陳瑞祥，佟曉娜，溫 瑾，李卓然，郭 玲

（云南省第三人民醫(yī)院，昆明 650011）

高脂血癥始變于動脈內(nèi)膜，有慢性炎癥性疾病典型的進行性和全身性的特點。高脂血癥可導致心腦血管疾病與消化類疾病，諸多研究表明，高脂血癥與動脈硬化性心血管疾病、腦梗、脂肪肝的發(fā)病有著密切聯(lián)系〔1〕。血漿中的膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL）是動脈粥樣硬化斑塊中的主要成分，異常的血脂與炎癥可共同導致動脈粥樣硬化〔2〕。目前關于高脂血癥的研究，包括發(fā)病病因、發(fā)病機制和預防防治方法，以及高效低毒的藥物的研制，已成為高脂血癥研究方面的研究熱點〔3〕。

高脂血癥研究中，模型的建立是研究的基礎和關鍵。大鼠有著便于飼養(yǎng)、取血方便、遺傳背景明確、成本低等優(yōu)點，是研究中建立模型的常用動物〔4〕。通過動物模型，可以更加方便、有效地了解疾病出現(xiàn)和發(fā)展的規(guī)律，研究防治措施，以及研發(fā)對抗藥物。

瑪咖（Lepidium meyenii Walp.）屬于十字花科獨行菜屬植物，原產(chǎn)于秘魯安第斯山脈高海拔地區(qū)，藥用瑪咖是其干燥成熟根。除了用于強身健體、改善性功能外，瑪咖還有抗抑郁、抗貧血等功效。有研究〔5-6〕發(fā)現(xiàn)，瑪咖能使血清中血脂水平降低，表明瑪咖有降血脂的功效。瑪咖營養(yǎng)成分研究表明，其含有高蛋白以及維生素和礦物質(zhì)微量元素，次生代謝成分有生物堿、多酚類、甾醇類、芥子油苷和異硫氰酸酯等〔7-8〕。有研究表明生活在高海拔地區(qū)的人們，由于飲食習慣，以及運動不方便等原因，他們的血液具有“濃、黏、聚、凝”的特點〔9〕，這不僅使他們?nèi)菀谆悸愿呱讲【C合征，還令他們罹患高脂血癥的可能性增大。在海拔4 100 m高原地區(qū)的研究發(fā)現(xiàn)，高海拔地區(qū)服用瑪咖的人群血壓水平、慢性高山病綜合征分數(shù)明顯低于同海拔未服用瑪咖的人群，同時服用瑪咖的人群健康指數(shù)高于未服用瑪咖的人群〔10〕?，斂Ы笛饔玫难芯?，對于高脂血癥和慢性高山病綜合征的預防和治療具有重要意義。

本研究采用高脂飼料喂養(yǎng)Wistar大鼠，通過高脂飼料喂飼法，建立Wistar大鼠的高脂血癥模型，從而對瑪咖醇提取物的降血脂作用進行基礎性研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只5周齡SPF級健康雄性Wistar大鼠，體重115～139 g，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所全國醫(yī)學靈長類研究中心小動物中心繁殖培養(yǎng)（合格證No.44007200038386）。

1.2 飼料 高脂飼料（基礎飼料70%，奶粉10%，豬油10%，蛋黃粉10%，魚肝油10滴。北京博泰宏達生物技術有限公司）；普通飼料。

1.3 藥品與儀器 云南麗江紫皮瑪咖的醇提取物（自制）；辛伐他汀（商品名：舒降之，批號：M031707，杭州默沙東制藥有限公司）；RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市瑞德儀器設備有限公司）；XYJ-2臺式高速離心機（江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所）；日本OLYMPUS AU2700全自動生化分析儀；冰箱。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂血癥模型建模實驗 50只5周齡SPF級健康的雄性Wistar大鼠，在標準實驗室的條件下適應性喂養(yǎng)1周后采血。采血前l(fā)天晚上禁食不禁水12 h，次日上午尾靜脈采血1～2 mL，測量大鼠血清中TG、TC、高密度脂蛋白（HDL）、LDL水平，并對大鼠的血脂水平進行評價，進行稱重。按照體重將大鼠隨機分為2組：一組作為空白對照組（10只），喂養(yǎng)普通飼料；另一組作為模型組（40只），喂養(yǎng)高脂飼料。大鼠自由進食、飲水。于喂養(yǎng)第5周后對大鼠進行稱重，尾靜脈采血約1～2 mL，冰箱4℃下沉淀1 h后，3 000 r∕min離心30 min，分離血清，用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中TG、TC、HDL、LDL水平。評價建模大鼠的血脂水平。

1.4.2 瑪咖醇提取物的制備 瑪咖干粉5 680 g，室溫下每次加入90%乙醇溶液5.0 L振搖提取48 h，提取3次。分離出總上清液進行抽濾，所得濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，進行減壓濃縮，得棕褐色浸膏1 556 g，1 g醇提取物相當于3.65 g藥材。浸膏用冰箱保存，臨用前用0.1%吐溫-80助溶后，加蒸餾水配成適宜濃度的混懸液備用。

1.4.3 藥物治療性實驗 將高脂血癥建模成功的40只大鼠，依據(jù)體重隨機分成陰性對照組、陽性對照組、高劑量藥物組、低劑量藥物組（高、低劑量由文獻支持〔7〕），每組10只，各組均以高脂飼料喂養(yǎng)。其中陰性對照組給予純凈水8 mL∕kg每日灌胃；陽性對照組以辛伐他汀20 mg∕kg每日灌胃；高劑量藥物組以瑪咖醇提取物0.68 g∕kg每日灌胃；低劑量藥物組以瑪咖醇提取物0.34 g∕kg每日灌胃；空白對照組（10只）健康大鼠，仍以普通飼料喂養(yǎng)。各組的飼料均由大鼠自由采食，飲水不限。于第15周取大鼠尾靜脈血約2～3 mL，冰箱4 ℃下沉淀1 h后，3 000 r∕min離心30 min，分離取血清，用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中TG、TC、HDL、LDL水平，并對大鼠進行稱重。

1.4.4 肝臟標本采集處理 于15周后將所有實驗大鼠禁食12 h，大鼠處死后取肝臟組織用生理鹽水沖洗，置于10%甲醛溶液中固定后，80%酒精中保存，脫水后再經(jīng)過透明浸蠟制片蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察組織的形態(tài)學變化，并比較各劑量組和對照組大鼠肝臟組織形態(tài)學差異。

1.5 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)應用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用單因素方差分析，并以LSD法進行組間比較，實驗結果均以（xˉ±s）表示，檢測的顯著性水平為α=0.05。顯著性P＜0.05時為差異有統(tǒng)計學意義，差異明顯；P＞0.05時為差異沒有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 大鼠外表變化 在建模實驗中，對照組的大鼠毛發(fā)光滑，精神狀態(tài)正常，活動量適中，反應敏捷，食量、排便量正常；模型組的大鼠與對照組的大鼠相比，毛發(fā)稍粗糙，有少許脫落，精神狀態(tài)正常，活動量偏少，進食量、排便量較對照組稍低。兩組大鼠均未出現(xiàn)個體死亡。

在藥物實驗中，陰性對照組的大鼠與空白對照組的大鼠相比，毛發(fā)稍粗糙，有少許脫落，精神狀態(tài)正常，活動量偏少，食量、排便量較對照組稍低；高劑量組、低劑量組、陽性對照組的大鼠與空白對照組的大鼠相比，精神狀態(tài)和反應明顯下降，不愿活動，食量、排便量、體重都下降且有個體差異，各組都有約2～3只大鼠死亡（實驗設計已考慮到此情況，每組安排動物數(shù)已足夠）。

2.2 血脂變化

2.2.1 建模實驗 在建模第5周后，對照組大鼠血清中的血脂水平建模前后變化不大，模型組大鼠建模后血清中的TG、TC、HDL水平與建模前相比均升高，LDL水平下降。建模后的數(shù)據(jù)經(jīng)過檢驗分析，發(fā)現(xiàn)模型組的大鼠與對照組的大鼠相比，血清中的TC、HDL、LDL含量高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 建模5周大鼠血脂水平（xˉ±s，模型組n=40，對照組n=10）

2.2.2 藥物實驗 藥物實驗第15周，分別測得空白對照組、陰性對照組、陽性對照組、高劑量組、低劑量組各組大鼠的血脂水平。與陰性對照組比較分析（見表2），空白對照組TG、TC、HDL、LDL比陰性對照組低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；陽性對照組TC、HDL、LDL比陰性對照組低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量組TC、LDL比陰性對照組低，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；低劑量組TC比陰性對照組低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與陽性對照組比較分析（見表3），高劑量組TC比陽性對照組高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HDL比陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；低劑量組TC比陽性對照組高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），HDL比陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），LDL比陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 藥物實驗后各組大鼠血脂水平（mmol∕L，xˉ± s，n=10）

表3 藥物實驗后劑量組與陽性對照組血脂水平（mmol∕L，xˉ± s，n=10）

2.3 大鼠肝臟病理切片變化 劑量干預組的大鼠肝臟組織的不同病理切片觀察結果可見：空白對照組肝細胞結構正常；陰性對照組肝細胞明顯脂肪變性，部分肝細胞體積增大，明顯變圓，胞漿出現(xiàn)數(shù)量不等的空泡，將細胞核擠壓到一側(cè)；陽性對照組肝細胞偶見脂肪變性，部分肝細胞體積增大，胞漿出現(xiàn)少量空泡；高劑量組與空白對照組相較肝細胞明顯脂肪變性，與陰性對照組相較胞漿中空泡數(shù)量較少，與陽性對照組相較差異無統(tǒng)計學意義；低劑量組與陰性對照組相較差異無統(tǒng)計學意義，肝細胞明顯脂肪變性，部分肝細胞體積增大，明顯變圓，胞漿出現(xiàn)數(shù)量不等的空泡，將細胞核擠壓到一側(cè)。見圖1。

3 討論

圖1 大鼠肝臟組織切片（HE染色，×200）

高脂血癥是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝異?；蛭蓙y引起的代謝性疾病，表現(xiàn)為血清中TC、TG和LDL過高，HDL過低〔8〕。目前人類高脂血癥在臨床醫(yī)學上根據(jù)血脂水平分為4類：高膽固醇血癥、高甘油三脂血癥、低高密度脂蛋白血癥和混合型高脂血癥。高膽固醇血癥主要表現(xiàn)為血清中TC含量增高；高甘油三酯血癥主要表現(xiàn)為血清中TG含量增高；低高密度脂蛋白血癥主要表現(xiàn)為血清中HDL含量降低；混合型膽固醇血癥則表現(xiàn)為血清中TC和TG的含量同時升高。HDL與HDL含量呈正相關，有研究表明HDL具有一定的抗動脈粥樣硬化作用。

大鼠的性別選擇上，有研究指出，雄性大鼠在建模成功后的血脂恢復能力比雌性大鼠差〔9〕，且雌性大鼠可能會出現(xiàn)懷孕和激素變化期等情況，為減少和避免不必要因素的干擾，本次研究采用雄性大鼠。

陽性對照藥物辛伐他汀是羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-COA）還原酶抑制劑。生物體內(nèi)的內(nèi)源性膽固醇，是在肝臟細胞的細胞質(zhì)中合成的。HMGCOA還原酶可催化HMG-COA還原為甲羥戊酸，為內(nèi)源性膽固醇合成中重要的一步，而他汀類藥物正是通過競爭性抑制HMG-COA還原酶〔13〕，降低HMG-COA還原為甲羥戊酸速率，減慢內(nèi)源性膽固醇的合成，從而降低血脂。文獻資料表明，辛伐他汀有降低TC、極低密度脂蛋白（VLDL）、LDL水平的作用，為常用的降血脂藥物。

在建模實驗中，與對照組分析比較，模型組大鼠血清中的TC、LDL明顯升高（P＜0.05）。高脂飼料中膽固醇的攝入可增加大鼠的外源性脂質(zhì)負荷，干擾大鼠的脂質(zhì)代謝，導致大鼠脂質(zhì)代謝異常或者紊亂，從而使大鼠患上高脂血癥。TG未能明顯升高的原因可能與高脂飼料成分和大鼠的個體差異等因素有關。實驗結果證明模型組成功建立Wistar大鼠的高脂血癥模型。

在藥物試驗第15周，各組與陰性對照組比較分析，發(fā)現(xiàn)空白對照組TC、HDL、LDL比陰性對照組低，且差異有統(tǒng)計學意義；陽性對照組TC、LDL比陰性對照組低，且差異有統(tǒng)計學意義；高劑量組TC、LDL比陰性對照組低，且差異有統(tǒng)計學意義；低劑量組TC比陰性對照組低，且差異有統(tǒng)計學意義。通過與陰性對照組的比較分析，說明正常實驗條件下，高劑量瑪咖的醇提取物有降低TC、LDL的作用，低劑量的瑪咖醇提取物只有降低TC的作用。與陽性對照組比較分析，高劑量組TC比陽性對照組高，且差異有統(tǒng)計學意義，HDL比陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學意義；低劑量組TC比陽性對照組高，且差異有統(tǒng)計學意義，HDL比陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學意義，LDL比陽性對照組高，差異有統(tǒng)計學意義；但高、低劑量組HDL與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。通過與陽性對照組的比較分析，發(fā)現(xiàn)瑪咖的醇提取物降TG、LDL的效果比辛伐他汀差。

通過大鼠肝臟病理切片變化可以發(fā)現(xiàn)高劑量組肝臟細胞脂肪變性情況與陽性對照組差異無統(tǒng)計學意義，程度弱于陰性對照組，強于空白對照組，對肝臟細胞脂肪變性有抑制作用且作用程度與辛伐他汀相似。低劑量組肝臟細胞脂肪變性情況與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義，程度弱于陽性對照組，強于空白對照組，對肝臟細胞脂肪變性幾乎無作用。

以上實驗結果表明，麗江紫皮瑪咖的醇提取物具有降血脂的作用，降血脂的效果與瑪咖醇提取物的濃度有關。由于大鼠個體具有體質(zhì)特異性，以及實驗用大鼠均為雄性，且統(tǒng)計數(shù)量少，缺乏廣泛代表性，可能導致誤差。另外，由于人類與大鼠在生理代謝等方面的不同，瑪咖醇提取物對人體的降血脂效果及作用原理有待進一步研究。

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