楊何寶 胡美榮 鄭翔 牟慶璇 高沛汝

（1. 河北省微生物研究所，保定 071051；2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100010）

傳統(tǒng)的制革工藝會(huì)產(chǎn)生大量污染，其中，以脫毛環(huán)節(jié)產(chǎn)生的污染最為嚴(yán)重［1］。近年來(lái)研究的清潔脫毛工藝主要有酶法脫毛［2］、灰堿法基礎(chǔ)上的保毛脫毛、有機(jī)胺脫毛、過(guò)氧化氫氧化脫毛等方法［3］。其中，蛋白酶法脫毛因條件溫和，對(duì)真皮中角蛋白水解少，且毛可回收，是目前為止最有可能代替灰堿法實(shí)現(xiàn)清潔脫毛工業(yè)化的方法［4］。然而酶法脫毛也有一些缺點(diǎn)，如酶蛋白質(zhì)量不穩(wěn)定、純度較低、專一性差等，會(huì)造成小毛脫不凈或爛面、松面、毛孔擴(kuò)大等問(wèn)題，尤其是酶系中含有水解皮膠原的膠原蛋白酶，在大規(guī)模應(yīng)用中如工藝控制不嚴(yán)會(huì)造成松面、爛皮現(xiàn)象［5］。因此酶脫毛在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中的操作控制難度較大。但從環(huán)保角度出發(fā)，酶法脫毛仍然是未來(lái)脫毛技術(shù)清潔化的發(fā)展方向。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外的一些學(xué)者關(guān)于信號(hào)肽載體構(gòu)建［6-10］和分子伴侶共表達(dá)［11-14］來(lái)提高外源蛋白在宿主菌中的表達(dá)做了很多研究。研究表明，針對(duì)不同的蛋白質(zhì)應(yīng)該選擇合適的信號(hào)肽來(lái)實(shí)現(xiàn)有效的分泌表達(dá)。Nagarajan等［15］選擇了4 種不同的酶蛋白信號(hào)肽，以芽孢桿菌 BE1510 為宿主菌，分別表達(dá)重組鏈霉抗生物素蛋白（Streptavidin），結(jié)果中性蛋白酶信號(hào)肽的分泌效率最高；Brockmeier等［16］嘗試了來(lái)源于枯草芽孢桿菌的 173 種信號(hào)肽對(duì)角質(zhì)酶分泌表達(dá)的影響，其中有 39 種信號(hào)肽不能實(shí)現(xiàn)角質(zhì)酶的分泌。研究表明，分子伴侶能夠幫助蛋白正確折疊，提高蛋白的可溶性表達(dá)，減少包涵體的形成。Pfeffer等［17］在E. coli表達(dá)目的蛋白的同時(shí)表達(dá)分子伴侶蛋白，提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)比例；陳飛等［18］的研究表明，在搖瓶中，相對(duì)于無(wú)分子伴侶的菌株，單獨(dú)整合分子伴侶PDI 及同時(shí)整合分子伴侶Ero1、PDI 菌株的CiP 酶活分別提高了2.43 和2.62 倍，活力達(dá)到316 U/mL 和340 U/mL。

鑒于此，本研究室前期構(gòu)建了一株產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株WB800N/pHT43-npr［19］，酶法脫毛與傳統(tǒng)的灰堿法效果相當(dāng)，并且該菌株剔除了膠原蛋白酶基因，不表達(dá)膠原蛋白酶，不會(huì)造成松面、爛皮、毛孔擴(kuò)大等問(wèn)題。但是，該菌株中性蛋白酶幾千的酶活表達(dá)能力較野生菌上萬(wàn)的酶活力還有很大差距，在實(shí)際應(yīng)用中成本較高，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。因此，在原有研究的基礎(chǔ)上，本研究擬通過(guò)篩選信號(hào)肽和整合分子伴侶來(lái)提高中性蛋白酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)，有助于實(shí)現(xiàn)重組中性蛋白酶的工業(yè)化生產(chǎn)，進(jìn)而促進(jìn)清潔化脫毛工藝的推廣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)所用菌株與質(zhì)粒及其相關(guān)特性描述見(jiàn)表 1。大腸桿菌 T1 用于質(zhì)粒的擴(kuò)增和PCR 片段的克隆。解淀粉芽孢桿菌 AS1.398作為供體菌，WB800N 作為宿主菌。

表1 菌株與質(zhì)粒

1.1.2 主要試劑和儀器 高保真DNA mix聚合酶，購(gòu)自MCLAB公司；限制性內(nèi)切酶Xma I、BamH I、高保真DNA組裝預(yù)混液、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自NEB公司；DNA maker、Protein maker購(gòu)自Thermo公司；IPTG購(gòu)自天根公司；Yeast和Tryptone購(gòu)自O(shè)XOID公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；PCR 儀購(gòu)自東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；核酸電泳儀購(gòu)自北京六一公司；蛋白電泳儀購(gòu)自君意公司；凝膠成像儀購(gòu)自天能公司；引物合成和DNA 測(cè)序由北京擎科生物科技公司完成。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（L）：10 g 胰蛋白胨，5g 酵母粉，10 g NaCl，121℃ 滅菌 20 min ；固體培養(yǎng)基加20 g/L 的瓊脂粉。牛奶平板培養(yǎng)基（L）：脫脂奶粉20 g，瓊脂20 g，115℃滅菌20 min。

1.1.4 PCR引物 本實(shí)驗(yàn)所用PCR引物見(jiàn)表2。

1.2 方法

常規(guī)分子生物學(xué)操作參照《分子克隆手冊(cè)》［20］。

1.2.1 不同信號(hào)肽重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以pHT43-npr重組質(zhì)粒為模版，設(shè)計(jì)特定引物QC-F和QC-R進(jìn)行PCR，去除質(zhì)粒上原有的信號(hào)肽基因，得到新的質(zhì)粒命名為pHT43-npr-N；然后，采用Quick Change引物設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)5組信號(hào)肽引物（表2，signal peptide primer），以pHT43-npr-N為模版進(jìn)行PCR，得到5個(gè)重組質(zhì)粒，分別為pHT43-npr-aprE、pHT43-npr-sacB、pHT43-npr-nprE、pHT43-npr-amyE、pHT43-npr-yncM。

1.2.2 不同分子伴侶重組質(zhì)粒的構(gòu)建 （1）克隆分子伴侶基因PrsA和DnaK：以枯草芽孢桿菌AS1.398基因組為模版，設(shè)計(jì)兩組分子伴侶引物進(jìn)行PCR（表2，molecular chaperone primer），核酸電泳驗(yàn)證，使用膠回收試劑盒回收分子伴侶片段。（2）質(zhì)粒酶切和新重組質(zhì)粒的構(gòu)建：對(duì)pHT43-npr質(zhì)粒進(jìn)行BamH I和Sma I雙酶切，得到pHT43片段和npr片段；再以npr片段和分子伴侶片段為模版，設(shè)計(jì)連接引物進(jìn)行PCR（表2，connected primer），得到npr+分子伴侶片段；最后采用Gibson連接方法將pHT43片段和npr+分子伴侶片段進(jìn)行連接，得到新的重組質(zhì)粒。

1.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1中 重組質(zhì)粒采用熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，然后涂布于LB固體平板（含100 μg/mL氨芐青霉素），37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.4 菌液PCR初步鑒定 用移液搶挑取轉(zhuǎn)化子單克隆至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-8 h后，進(jìn)行菌液PCR。菌液PCR引物如表2。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測(cè)驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的菌落。

由于信號(hào)肽片段較短，無(wú)法通過(guò)此方法進(jìn)行驗(yàn)證，所以直接測(cè)序驗(yàn)證。

表2 引物序列

1.2.5 重組質(zhì)粒DNA測(cè)序及檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的正確性 將菌落PCR鑒定為陽(yáng)性克隆的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行5 mL LB液體試管培養(yǎng)12-16 h，并送往擎科生物（北京）股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序引物如表2（sequencing primer）；將測(cè)序后獲得的序列用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)以驗(yàn)證序列的正確性和該方法的可靠性。

1.2.6 轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N 將驗(yàn)證正確的菌株37℃培養(yǎng)8-12 h，用NEB公司Plamid Miniprep Kit試劑盒小量提取質(zhì)粒，取10 μL質(zhì)粒加入到400μL枯草芽孢桿菌WB800N感受態(tài)中，37℃，220 r/min培養(yǎng)2 h；涂布于LB固體平板（含10 μg/mL氯霉素），37℃過(guò)夜培養(yǎng)。

1.2.7 牛奶平板初步驗(yàn)證 用移液槍挑取轉(zhuǎn)化子于牛奶平板驗(yàn)證中性蛋白酶活性，37℃培養(yǎng)1-3 h，有水解圈生成的菌落即為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

1.2.8 重組菌株表達(dá)中性蛋白酶酶活性的測(cè)定及蛋白電泳分析 將對(duì)照菌株（WB800N/pHT43-npr）與重組菌株按4%的比例接種于10 μL/mL CmR的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min培養(yǎng)。當(dāng)菌體OD600=0.5左右時(shí)，添加1‰IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)酶，誘導(dǎo)24 h后取樣，采用Folin-酚法測(cè)定中性蛋白酶酶活性，并對(duì)重組菌株表達(dá)的中性蛋白酶進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。

圖1 pHT43-npr-N質(zhì)粒電泳分析

2.1.2 不同信號(hào)肽重組質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1、酶切及測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證 由圖2可知，5個(gè)重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)雙酶切電泳后，均有兩條特異性條帶，并且中性蛋白酶基因npr的條帶位置正確；同時(shí)，測(cè)序結(jié)果用DANMAN進(jìn)行比對(duì)，5個(gè)信號(hào)肽片段測(cè)序結(jié)果與實(shí)際序列完全重合，說(shuō)明了重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，并成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌T1中。

2.1.3 不同信號(hào)肽重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N及牛奶平板驗(yàn)證結(jié)果 由圖3可知，與對(duì)照菌株（WB800N/pHT43-npr）相比，5株重組菌株涂牛奶平板后雖有菌落生成，但均無(wú)水解圈生成，說(shuō)明5株菌沒(méi)有分泌中性蛋白酶。

2.1.4 不同信號(hào)肽重組菌株中性蛋白酶酶活驗(yàn)證結(jié)果 以LB液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)添加誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，24 h后測(cè)酶活性。由表3可知，兩株重組菌株的發(fā)酵酶活性均顯著低于對(duì)照菌株（WB800N/pHT43-npr），3株重組菌株不表達(dá)中性蛋白酶。

圖2 不同信號(hào)肽重組質(zhì)粒雙酶切電泳驗(yàn)證

圖3 不同信號(hào)肽重組菌株涂牛奶平板結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 不同信號(hào)肽重組質(zhì)粒的構(gòu)建、驗(yàn)證、轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

2.1.1 pHT43-npr質(zhì)粒中原有信號(hào)肽基因剔除的結(jié)果 以pHT43-npr質(zhì)粒為模版，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR剔除原有的信號(hào)肽序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果（圖1）顯示，pHT43-npr-N質(zhì)粒的基因大小為9 428 bp，條帶清晰，無(wú)雜帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2 不同分子伴侶重組質(zhì)粒的構(gòu)建、驗(yàn)證、轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

2.2.1 克隆分子伴侶基因PrsA和DnaK結(jié)果 分子伴侶PrsA片段基因長(zhǎng)度為876 bp，DnaK片段長(zhǎng)度為1 836 bp，兩個(gè)分子伴侶位置條帶正確（圖4）。

2.2.2 構(gòu)建新重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1酶切驗(yàn)證結(jié)果 npr+PrsA片段基因長(zhǎng)度為2 352 bp，npr+DnaK片段基因長(zhǎng)度為3 312 bp。由圖5可知，通過(guò)菌液PCR、核酸電泳驗(yàn)證，兩條片段在相應(yīng)位置均有特異性條帶，且大小與預(yù)期相符。

表3 不同信號(hào)肽重組質(zhì)粒誘導(dǎo)發(fā)酵24 h酶活測(cè)定結(jié)果

圖4 克隆分子伴侶片段電泳驗(yàn)證

圖5 菌液PCR驗(yàn)證電泳圖

2.2.3 不同分子伴侶重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌WB800N及牛奶平板驗(yàn)證結(jié)果 由圖6可以看出，牛奶平板有水解圈生成，說(shuō)明菌落周圍有中性蛋白酶存在。

2.2.4 不同分子伴侶重組菌株中性蛋白酶酶活驗(yàn)證及蛋白電泳分析結(jié)果 由圖7可知，兩株重組菌株和對(duì)照菌株在30-40 kD之間均有一條特異性條帶，說(shuō)明兩株重組菌株成功后表達(dá)了中性蛋白酶。與對(duì)照菌株相比，兩株重組菌株發(fā)酵酶活都有所增加，分別增加了23%和33%（圖8）。

圖6 不同分子伴侶重組菌株涂牛奶平板結(jié)果

圖7 不同重組菌株中性蛋白酶SDS-PAGE結(jié)果

圖8 不同重組菌株發(fā)酵酶活對(duì)比結(jié)果

3 討論

隨著制革業(yè)對(duì)清潔化生產(chǎn)工藝的需求，酶法脫毛制革因酶制劑來(lái)源廣泛、易獲得、無(wú)毒害和污染小等優(yōu)點(diǎn)成為替代傳統(tǒng)灰堿法脫毛工藝的首選［21-22］。目前市場(chǎng)中的脫毛酶如1398中性蛋白酶和來(lái)源于其他枯草芽孢桿菌的中性蛋白酶，雖然可以完成脫毛工藝，但是酶制劑中有膠原蛋白酶的存在，會(huì)造成皮面爛面、毛孔粗大等問(wèn)題，使得酶法脫毛很難在制革工藝中規(guī)?；茝V。目前大多數(shù)研究集中在菌株發(fā)酵條件優(yōu)化［23-24］、菌種誘變選育［25-26］和不同外源系統(tǒng)表達(dá)［27-28］等技術(shù)來(lái)提高中性蛋白酶的表達(dá)上。雖然這些技術(shù)能在一定程度上提高酶的產(chǎn)量，但利用信號(hào)肽和分子伴侶來(lái)提高中性蛋白酶的表達(dá)還罕見(jiàn)報(bào)道。枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)是一種成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，本研究選用的宿主菌為剔除膠原蛋白酶基因的枯草工程菌株WB800N，從源頭上消除了膠原蛋白酶對(duì)皮膠原的影響。然而外源蛋白在進(jìn)行分泌表達(dá)過(guò)程中往往水平較低，大量研究表明［15-18，29-36］，選擇適合的信號(hào)肽和分子伴侶可以提高蛋白的表達(dá)。本文通過(guò)篩選信號(hào)肽和整合分子伴侶兩種技術(shù)手段，來(lái)提高中性蛋白酶基因（npr）的胞外表達(dá)。構(gòu)建的5株信號(hào)肽重組菌株雖然不能表達(dá)中性蛋白酶，但對(duì)以后的科研提供了一定的參考；成功構(gòu)建的2株整合分子伴侶的重組質(zhì)粒對(duì)中性蛋白酶的表達(dá)均有一定的提高，整合PrsA和整合DnaK使目的蛋白酶活分別提高了23%和33%，說(shuō)明兩個(gè)分子伴侶成功地幫助了中性蛋白酶基因進(jìn)行更快速的折疊和組裝。

本研究通過(guò)篩選信號(hào)肽和整合分子伴侶促進(jìn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和正確折疊從而提高中性蛋白酶表達(dá)量，為該酶的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用打下基礎(chǔ)，對(duì)促進(jìn)其他外源蛋白在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)提供了新的思路和借鑒。本文通過(guò)研究信號(hào)肽和分子伴侶對(duì)中性蛋白酶分泌表達(dá)的影響，得到了一些有意義的結(jié)果，但仍有一下幾方面有待進(jìn)一步研究：

（1）重組菌株 WB800/pHT43-npr-PrsA和 WB-800/pHT43-npr-DnaK的發(fā)酵培養(yǎng)采用的是 LB 培養(yǎng)基，為了提高分泌量，可以對(duì)培養(yǎng)基成分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化；（2）本研究?jī)H選取了 5種信號(hào)肽來(lái)替換原始信號(hào)肽amyQ 基因，得到的結(jié)果不理想。下一步研究可選取更多具有代表性的信號(hào)肽或者以高通量的手段建立載體庫(kù)，系統(tǒng)化的分析在不同信號(hào)肽的引導(dǎo)下，具有不同結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分泌效率的規(guī)律；（3）本研究只做了整合一種分子伴侶重組菌株的構(gòu)建，對(duì)于整合兩種或多種分子伴侶對(duì)目的蛋白的分泌表達(dá)的影響可作為將來(lái)的研究方向；（4）本文未對(duì)重組酶的酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用做進(jìn)一步研究，此可作為下一步的研究方向。

4 結(jié)論

通過(guò)篩選信號(hào)肽和整合分子伴侶到重組質(zhì)粒上，成功構(gòu)建了兩株整合分子伴侶的重組菌株，中性蛋白酶發(fā)酵酶活比對(duì)照分別提高了23%和33%。

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