王 瓊，王麗媛，張 莉，倪玲芬

(中國人民解放軍第四醫(yī)院：1.檢驗科；2.內(nèi)科，西寧 810007)

小腸上皮細胞是具有極性的柱狀上皮細胞，參與腸道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和應(yīng)激反應(yīng)等過程，黏膜上皮內(nèi)含有大量的免疫細胞核免疫分子，是機體內(nèi)最大的免疫組織[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者體內(nèi)血糖水平在長期得不到控制的情況下并發(fā)膽石癥的概率明顯升高，其機制尚未完全明確，但是與膽固醇在腸道吸收增加有明顯關(guān)聯(lián)[4-5]。極化的單層人結(jié)腸癌上皮細胞Caco-2被認為是與小腸上皮細胞最為相似的細胞，廣泛作為小腸上皮細胞轉(zhuǎn)運和代謝的體外模型使用[6]。本研究觀察高濃度葡萄糖溶液對人結(jié)腸癌上皮細胞Caco-2膽固醇吸收的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 Caco-2細胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞分庫，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，膽固醇購自美國Sigma公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，CCK-8試劑盒購自日本同人化學(xué)研究所，膽固醇檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。膽固醇微膠溶液配制方法：將濃度為3 mmol/L的膽鹽、30 mol/L的甘油單油酸脂、1.25×105μmol/L的14C-膽固醇加入DMEM培養(yǎng)液中，使用超聲將其混合均勻，通過0.20 μm濾膜過濾，在37 ℃保溫箱保存。將膽固醇抑制劑(依折麥布)溶于0.2% DMSO中，保存于37 ℃保溫箱。

1.2方法

1.2.1Caco-2細胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基選擇含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液2 d更換1次，直至細胞長至培養(yǎng)瓶容積的80%～90%，進行傳代培養(yǎng)，選擇對數(shù)期和生殖狀態(tài)均比較穩(wěn)定的細胞，采用10%DMSO冷凍于-80 ℃的冰箱備用。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖 將Caco-2細胞以5×103個/孔接種于96孔板，設(shè)置5個復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中放置12 h，直至細胞貼壁，分別加入濃度為12.5、100.0、300.0、700.0、1 000.0、1 388.0 mmol/L的葡萄糖溶液50 μL進行24 h培養(yǎng)，然后加入10 μL的CCK-8溶液，再培養(yǎng)2 h，使用酶標儀檢測450 nm波長的吸光度(OD)值，計算細胞增殖率，確定葡萄糖溶液對Caco-2細胞的半數(shù)抑制濃度。細胞增殖率=A2+(A1-A2)/1+(X/X0)，其中A為3次OD均值，X為葡萄糖溶液濃度。

1.2.3檢測Caco-2細胞膽固醇吸收量 將Caco-2細胞分為膽固醇組、膽固醇+依折麥布組、空白組。膽固醇組：向培養(yǎng)板中加入100 μmol/L的膽固醇溶液及5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h。膽固醇+依折麥布組：向培養(yǎng)板中加入100 μmol/L依折麥布和100 μmol/L膽固醇溶液及5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液，孵育24 h。空白組：向培養(yǎng)板中加入DMEM培養(yǎng)基及對應(yīng)濃度的DMSO。根據(jù)膽固醇測試說明書，使用分光光度計比色，測定OD。膽固醇濃度=(標本OD值-空白OD值)×校準品濃度/(校準OD值-空白OD值)×待測標本蛋白濃度。重復(fù)3次試驗取平均值作為最終檢測結(jié)果。

1.2.4WB檢測ABCG8、ABCG5、NPC1L1、SR-BI蛋白表達 將Caco-2細胞分為葡萄糖組、葡萄糖+依折麥布組、對照組。葡萄糖組：分別加入5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液。葡萄糖+依折麥布組：分別加入5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液和100 μmol/L依折麥布。對照組：加入100 μmol/L依折麥布。各組均培養(yǎng)24 h，然后洗滌細胞，加入RIPA裂解液，對細胞總蛋白進行提取。使用BCA蛋白定量試劑對其進行蛋白定量，使用SDSPAGE凝膠制備試劑盒配制10%分離膠及5%濃縮膠，電泳，然后轉(zhuǎn)運蛋白至PVDF膜，加入5%牛奶封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育1.5 h，使用電化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，凝膠圖像系統(tǒng)對各蛋白條灰度值進行分析，試驗操作重復(fù)3次，取平均值。以目的蛋白與內(nèi)參照GAPDH灰度值的比較作為目的蛋白表達水平。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度葡萄糖溶液對Caco-2細胞增殖的影響 CCK-8檢測結(jié)果顯示，葡萄糖溶液濃度為12.5、100.0、300.0、700.0、1 000.0、1 388.0 mmol/L時，Caco-2細胞增殖率分別為(1.381±0.051)%、(1.239±0.069)%、(0.737±0.031)%、(0.334±0.020)%、(0.315±0.022)%、(0.284±0.009)%，不同葡萄糖溶液濃度Caco-2細胞增殖率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，葡萄糖溶液對于Caco-2細胞半數(shù)抑制濃度為281.18 mmol/L。

2.2不同濃度葡萄糖溶液對Caco-2細胞膽固醇吸收量的影響 見表1。在5.0、25.0、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液中，膽固醇組Caco-2細胞膽固醇吸收量均明顯高于膽固醇+依折麥布組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但其差異隨葡萄糖溶液濃度增加而減少。

表1 不同濃度葡萄糖溶液對兩組Caco-2細胞膽固醇吸收量比較

2.3不同濃度葡萄糖溶液對Caco-2細胞膽固醇轉(zhuǎn)運基因ABCG8、ABCG5、NPC1L1、SR-BI表達的影響 見表2。WB檢測結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖對Caco-2細胞膽固醇轉(zhuǎn)運基因ABCG8、ABCG5、SR-BI表達無明顯影響，但對NPC1L1基因表達的影響明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 不同濃度葡萄糖溶液對兩組Caco-2細胞轉(zhuǎn)運蛋白表達的影響

3 討 論

Caco-2細胞模型是一種結(jié)構(gòu)和功能與分化的小腸上皮細胞非常類似的細胞，其具有微絨毛等結(jié)構(gòu)及小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶系，因此往往應(yīng)用在模擬腸轉(zhuǎn)運的相關(guān)研究中[7]。本研究通過Caco-2細胞的這種特性觀察高濃度葡萄糖溶液對其膽固醇吸收情況的影響，以此驗證高濃度葡萄糖對人體小腸細胞膽固醇吸收的影響。

膽石癥是成年人好發(fā)的一種消化系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率隨年齡增長而升高[8-9]。膽石癥的病因尚未完全清楚，但是認為所有影響膽固醇與膽汁酸濃度比例改變及造成膽汁淤滯的因素均可影響膽結(jié)石形成，因為膽汁酸減少或者膽固醇過多均可導(dǎo)致膽汁中的膽固醇呈現(xiàn)過飽和狀態(tài)，從而使其沉淀析出，形成膽結(jié)石，而影響這一過程的因素有多種[10]。近年來研究表明，血糖控制不佳的糖尿病患者，其合并膽石癥的概率比非糖尿病患者高1～2倍[11]。

本研究CCK-8檢測結(jié)果顯示，在不同濃度葡萄糖溶液中，Caco-2細胞增殖差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，葡萄糖對于Caco-2細胞半數(shù)抑制濃度為281.18 mmol/L。Caco-2細胞增殖率隨葡萄糖濃度升高而降低，在5.0、25.0L、50.0 mmol/L的葡萄糖溶液中，膽固醇組Caco-2細胞膽固醇吸收量均明顯高于膽固醇+依折麥布組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但其差異隨葡萄糖溶液濃度增加而減少，說明依折麥布能夠降低膽固醇的吸收率。從基因角度來看，WB檢測結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖對Caco-2細胞膽固醇轉(zhuǎn)運基因ABCG8、ABCG5、SR-BI表達無明顯影響，但是對NPC1L1基因表達影響明顯，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NPC1L1基因在Caco-2細胞中出現(xiàn)高表達，說明這是膽固醇在腸道吸收過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)運蛋白，因此，在調(diào)節(jié)小腸對膽固醇的重吸收過程中起重要作用，是膽固醇吸收抑制劑依折麥布分子的作用靶點。

綜上所述，高濃度葡萄糖溶液可能通過增加Caco-2細胞中NPC1L1蛋白的表達起到促進膽固醇重吸收的作用，這可能是導(dǎo)致糖尿病患者增加合并膽石癥概率的重要因素。

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