王 剛，廖翠屏，劉 敏，溫亞楠

(四川省成都市溫江區(qū)婦幼保健院檢驗(yàn)科 611130)

人乳腺球蛋白是由乳腺癌上皮細(xì)胞克隆而來的乳腺癌相關(guān)蛋白，其在約85%的乳腺癌中呈過高表達(dá)，但并不表達(dá)于其他癌組織，因此有較高的乳腺癌組織特異性[1-2]。本研究選取乳腺癌組織、癌旁正常組織及乳腺良性病變組織標(biāo)本，通過免疫組化方法、組織微陣列技術(shù)及反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)對(duì)上述組織標(biāo)本中人乳腺球蛋白及其mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析其表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性，分析其與乳腺癌發(fā)生和發(fā)展的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2015年1月至2017年8月乳腺癌組織(A組)、癌旁正常組織(B組)及乳腺良性病變組織(C組)標(biāo)本各40例。A組患者年齡24～65歲，平均(49.95±6.57)歲；B組患者年齡21～68歲，平均(51.06±7.47)歲；C組患者年齡22～69歲，平均(50.63±7.48)歲。3組的年齡、病理分型等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。40例乳腺癌的病理分型：浸潤(rùn)型35例，非浸潤(rùn)型5例；TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期21例，Ⅲ期7例，Ⅳ期1例；發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。本研究?jī)?nèi)容已通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1RT-PCR引物設(shè)計(jì) 按照人乳腺球蛋白mRNA序列，通過Primer Premier 5.0軟件對(duì)PCR引物上、下游序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，其中人乳腺球蛋白mRNA引物序列長(zhǎng)度為320 bp，β-actin序列長(zhǎng)度為490 bp；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成和純化。

1.2.2RT-PCR檢測(cè) 采用Trizol提取液一步法提取細(xì)胞總RNA。并通過一步法進(jìn)行RT-PCR操作，嚴(yán)格按照PCR試劑盒(購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)說明書進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，以相同溫度進(jìn)行變性30 s，58 ℃退火40 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，在62 ℃延伸3 min，72 ℃總延伸5 min；反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(Quit eDNA第一鏈合成試劑盒)，將β-actin作為內(nèi)參照。根據(jù)PCR擴(kuò)增儀(購自美國(guó)ABI公司，型號(hào)2720型)及SYBRGreen試劑盒說明書完成操作，其反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，以相同溫度變性30 s，58 ℃退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后，在62 ℃延伸60 s，68 ℃總延伸3 min。

1.2.3免疫組化檢測(cè) 全部標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛進(jìn)行固定處理，并用石蠟進(jìn)行包埋，制成微陣列芯片(孔徑3 mm，含40個(gè)組織芯)，4 mm切片；選用2張用于免疫組織化學(xué)染色，另選1張用于HE染色；通過磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，嚴(yán)格按試劑盒說明書完成相應(yīng)操作。

1.3免疫組化結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)[3]人乳腺球蛋白陽性定義：胞漿、細(xì)胞膜存在棕色顆粒，反之為陰性。隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，觀察陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度，0分：無顯色；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。并對(duì)陽性細(xì)胞在總細(xì)胞數(shù)所占百分比進(jìn)行評(píng)分，陰性：0分；陽性細(xì)胞在25%及以下：1分；陽性細(xì)胞>25%～50%：2分；陽性細(xì)胞>50%～75%：3分；陽性細(xì)胞>75%～100%：4分。將陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度及其百分比得分相加，其中0～3分為陰性，>3～7分為陽性。

2 結(jié) 果

2.13組人乳腺球蛋白陽性結(jié)果及其mRNA表達(dá)水平比較 見表1。A組人乳腺球蛋白陽性率明顯高于B、C組，且其mRNA表達(dá)水平也明顯高于B、C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而B組與C組mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 3組人乳腺球蛋白陽性結(jié)果及其mRNA表達(dá)水平比較

注：與B、C組比較，*P<0.05

2.2乳腺癌組織中人乳腺球蛋白陽性率與臨床病理特征的相關(guān)性 見表2。乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及雌激素受體(ER)水平均密切相關(guān)(P<0.05)，其中組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)、發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER陽性者人乳腺球蛋白的陽性率明顯高于組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER陰性者；而人乳腺球蛋白陽性率與病理類型、TNM分期、腫瘤大小及孕激素受體(PR)均無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表2 乳腺癌組織中人乳腺球蛋白陽性率與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

續(xù)表2 乳腺癌組織中人乳腺球蛋白陽性率與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

2.3多因素Logistic回歸分析結(jié)果 見表3。將乳腺癌組織中人乳腺球蛋白作為因變量，臨床病理特征各項(xiàng)指標(biāo)作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。提示乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、PR及ER水平均存在明顯關(guān)系(P<0.05)。

表3 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是引起乳腺癌患者死亡的主要因素之一。有研究報(bào)道，早期乳腺癌不排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性[4-5]。近年來，腫瘤標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷、療效及預(yù)后評(píng)價(jià)中，并且也廣泛用于高危人群的隨訪研究中。其中糖類抗原153(CA153)、癌胚抗原(CEA)及CA125均為目前臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，但因其靈敏度和組織臟器特異度通常低于25%，因此并非是診斷乳腺癌和疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的確切指標(biāo)[6-8]。所以，探索一種或多種更為確切有效的乳腺癌特異性標(biāo)志物對(duì)提高疾病的準(zhǔn)確率及轉(zhuǎn)移判斷顯得尤為重要。人乳腺球蛋白是經(jīng)93個(gè)氨基酸序列組合而成，其基因處于染色體11q13。既往有研究指出，人乳腺球蛋白有理想的乳腺癌組織特異度，可作為診斷乳腺癌的重要指標(biāo)[9]。

本研究采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)法對(duì)乳腺癌組織、癌旁正常組織及乳腺良性病變組織中人乳腺球蛋白及其mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A組人乳腺球蛋白陽性率明顯高于B、C組，并且其mRNA表達(dá)水平也明顯高于B、C組；但B組與C組及其mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與文獻(xiàn)[10-11]研究報(bào)道吻合。本研究結(jié)果表明，人乳腺球蛋白及其mRNA在乳腺癌組織中表達(dá)較高，在癌旁正常組織的表達(dá)較低，而在乳腺良性病變組織中并無表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER均密切相關(guān)，其中組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)、發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER陽性者人乳腺球蛋白的陽性率明顯高于組織學(xué)分級(jí)為Ⅰ級(jí)、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER陰性者，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致；而人乳腺球蛋白陽性率與病理類型、TNM分期、腫瘤大小及PR均無明顯相關(guān)性。多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、PR及ER均存在明顯關(guān)系。本研究結(jié)果表明，組織學(xué)分級(jí)、PR及ER可能是人乳腺球蛋白表達(dá)的影響因素，可進(jìn)一步推斷人乳腺球蛋白可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用，并且隨著其表達(dá)水平升高，腫瘤分化程度加重，進(jìn)而導(dǎo)致其惡性程度升高、腫瘤侵襲性提高。所以，人乳腺球蛋白可能是評(píng)估乳腺癌腫瘤侵襲能力及惡性程度的重要指標(biāo)。

目前，有關(guān)人乳腺球蛋白的表達(dá)水平與乳腺癌ER、PR相關(guān)性的看法尚未明確，但有研究指出，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的陽性率與ER并無明顯關(guān)系，而與PR存在明顯關(guān)系[13]。另有研究指出，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的陽性率與ER存在明顯關(guān)系，而與PR并無明顯關(guān)系[14-15]。本研究結(jié)果表明，人乳腺球蛋白陽性率與ER密切相關(guān)，而與PR陽性與否并無明顯關(guān)系；進(jìn)一步采用多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中人乳腺球蛋白的表達(dá)與PR及ER均存在明顯關(guān)系。與上述研究存在爭(zhēng)議的原因可能因χ2檢驗(yàn)是獨(dú)立樣本量百分率的基因，并不會(huì)受混雜因素的影響；而Logistic回歸分析作為多變量分析方法之一，是分析二分類觀察結(jié)果與某些因素間的關(guān)系，所以其受混雜因素的干擾較大。并且，雌二醇作為孕酮受體合成的啟動(dòng)因素，PR需在ER存在時(shí)才能起到一定作用。所以，單獨(dú)PR陽性表達(dá)可能對(duì)人乳腺球蛋白表達(dá)的影響較小，故二者并未存在密切聯(lián)系。但PR與ER同時(shí)呈陽性表達(dá)時(shí)可能起到彼此協(xié)同作用而使人乳腺球蛋白表達(dá)水平升高、陽性率升高，但有關(guān)具體影響機(jī)制尚未定論，仍需今后進(jìn)一步探討。

綜上所述，人乳腺球蛋白在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，并且其與組織學(xué)分級(jí)、PR及ER密切相關(guān)，其可能參與乳腺癌的發(fā)病過程，可作為評(píng)估患者腫瘤侵襲能力及惡性程度的重要指標(biāo)。

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