陳劍峰，沈宗坤

(遼寧省阜新市中心醫(yī)院檢驗科 123000)

食管癌是臨床上最常見的惡性消化道腫瘤之一，其病死率位居我國惡性腫瘤第4位[1-2]。食管癌發(fā)病早期無明顯癥狀，大多數(shù)患者確診時已為中晚期，此時治療預后效果極差，患者5年生存率不足15%[3]。尋找新型診斷及預后標志物對于臨床治療食管癌及改善患者預后有十分重要的臨床價值。近年來，微小RNA(miRNA)研究為腫瘤靶向研究提供了新的方向，成為目前腫瘤研究的重大熱點[4]。本研究旨在探討食管癌組織中miR-203和miR-21表達水平及其臨床意義，為臨床治療食管癌提供新的診斷及治療靶點,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2011年9月至2013年9月本院病理科47例食管癌組織標本及相應癌旁正常組織標本(距癌灶邊緣4 cm以上)，所有標本臨床資料及預后資料完整。47例患者均為鱗狀細胞癌，其中男29例，女18例；年齡32～71歲，平均(57.37±6.45)歲；TNM分期Ⅰ期7例，Ⅱ期11例，Ⅲ期15例，Ⅳ期14例；高分化15例，中分化14例，低分化18例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，且臨床標本采集符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2納入和排除標準

1.2.1納入標準 (1)經(jīng)組織病理學診斷確診為食管癌者；(2)年齡<72歲，性別不限；(3)術(shù)前未接受放化療及激素等治療者；(4)臨床病理資料及隨訪資料完整者；(5)患者及家屬了解本研究，并簽署知情同意書者。

1.2.2排除標準 (1)排除懷孕及哺乳期婦女；(2)排除伴有肝臟、心臟、肺、腎臟等嚴重疾病者；(3)排除有食管癌家族史者；(4)排除組織標本不完善及處理方法不合格者；(5)排除合并其他腫瘤者。

1.3試劑與儀器 Trizol購自美國Invitrogen公司；miRNeasy提取分離試劑盒購自美國Qiagen公司；瓊脂糖購自法國Biowest公司；miRNA Reverse Transcription Kit購自美國ABI公司；dNTPs、10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit購自日本TaKaRa公司；聚合酶鏈反應(PCR)引物由上海生工公司合成；熒光定量PCR(qRT-PCR)儀ABI7700購自美國ABI公司；紫外分光光度計購自美國Beckman公司。

1.4qRT-PCR 采用qRT-PCR檢測miR-203、miR-21 mRNA水平。采用miRNeasy提取分離試劑盒提取食管癌組織及癌旁正常組織中miRNA，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明進行，所提miRNA經(jīng)OD測定，OD260/OD280為1.8～2.0。采用miRNA Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄操作，所得cDNA作為qRT-PCR反應模板。qRT-PCR引物序列見表1，由上海生工合成。qRT-PCR采用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit miRNA定量擴增體系進行，以U6為內(nèi)參基因，采用qRT-PCR儀ABI7700進行反應擴增。qRT-PCR反應體系如下(10 μL)：cDNA 1 μL，SYBR Primix Ex Taq TM 5 μL，Primer 0.5 μL，RNase H2O 3 μL。qRT-PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT方法處理結(jié)果，其中ΔΔCT=(CT目的基因-CTU6)觀察-(CT目的基因-CTU6)對照。

表1 qRT-PCR擴增引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組miR-203、miR-21表達水平比較 見表2。食管癌組織中miR-203表達水平明顯低于癌旁正常組織， miR-21表達水平明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 兩組miR-203、miR-21表達水平比較

2.2食管癌組織中miR-203、miR-21表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 見表3。miR-203表達與食管癌患者臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與食管癌患者年齡、性別、腫瘤位置無明顯相關(guān)性(P>0.05)；miR-21表達與食管癌患者臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)，與食管癌患者年齡、性別、腫瘤位置無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表3 食管癌組織中miR-203、miR-21表達與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

2.3食管癌組織中miR-203、miR-21表達與患者預后的關(guān)系 見圖1、2。miR-203高表達組生存率明顯高于miR-203低表達組，miR-21低表達組生存率明顯高于miR-21高表達組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 食管癌組織中miR-203表達與患者預后的關(guān)系

圖2 食管癌組織中miR-21表達與患者預后的關(guān)系

2.4食管癌組織中miR-203、miR-21表達的相關(guān)性 Spearman秩和檢驗結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-203與miR-21表達呈明顯負相關(guān)(r=-0.564,P<0.05)。

3 討 論

流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，我國食管癌發(fā)病率及病死率居世界首位，嚴重危害我國居民的身體健康及生命安全[5]。食管癌早期癥狀主要為燒灼感、胸骨后不適及輕度哽咽感，常被忽略[6]。大多數(shù)患者確診時已出現(xiàn)食物反流、進行性吞咽困難及惡病質(zhì)等，此時已為中晚期，患者預后極差，生存率不足15%。有研究表明，早期診斷并及時治療對于提高食管癌預后及生存率有積極意義[7]。因此，尋找積極有效的食管癌早期診斷及預后生物學標志物，是目前臨床治療食管癌亟待解決的關(guān)鍵性問題。

近年來，miRNAs的發(fā)現(xiàn)及深入研究為腫瘤靶向研究提供了新的思路。多種miRNAs表達與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后有密切關(guān)系，已引起國內(nèi)外廣大學者的高度重視[8]。miRNAs現(xiàn)已成為腫瘤靶向研究的重要熱點，揭示更多miRNAs生物學功能為認識及攻克人類腫瘤提供了一種重大突破口。越來越多的miRNAs被證實為抑癌或促癌基因，參與人類多種惡性腫瘤多條信號通路傳導，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miR-203是miRNAs家族重要成員之一，位于人類第14號染色體q32.33位點，長110 bp，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種具有皮膚特異性miRNA[9]。有研究表明，miR-203在舌癌、非小細胞肺癌、慢性髓細胞白血病等多種腫瘤組織中異常表達，與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移及侵襲過程密切相關(guān)[10-12]。梁佳等[13]研究結(jié)果顯示，miR-203在食管鱗癌組織及細胞中呈明顯低表達，推測其異常表達與食管鱗癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-203表達水平為0.35±0.21，明顯低于癌旁正常組織的0.87±0.14。由此提示，miR-203在食管癌組織中呈明顯低表達，可能參與食管癌的發(fā)生及發(fā)展過程，與上述研究結(jié)果一致。本研究中miR-203表達與食管癌臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。提示隨著食管癌的進展，miR-203表達明顯降低，miR-203參與食管癌發(fā)生及腫瘤進展。miR-203高表達組患者5年生存率明顯高于miR-203低表達組，提示miR-203作為抑癌基因在食管癌中發(fā)揮重要作用，推測miR-203可作為早期診斷食管癌及判斷患者預后的重要生物學靶點，具有較高的臨床價值。

miR-21在人類細胞及組織中廣泛存在，且是發(fā)現(xiàn)較早的miRNA之一，可通過與其靶基因3′端的非編碼區(qū)域相結(jié)合，遏制其靶基因表達，參與多種腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲過程。SHANG等[14]研究結(jié)果顯示，miR-21在人類膠質(zhì)母細胞瘤細胞中呈明顯上調(diào)表達，且可通過靶向FASLG基因介導膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖及凋亡過程。YANG等[15]研究結(jié)果顯示，miR-21在非小細胞肺癌中呈明顯高表達，且其高表達水平對于非小細胞肺癌患者預后總生存率有負面影響，推測miR-21可作為預測非小細胞肺癌復發(fā)及不良預后的有效生物學標志。本研究結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-21表達水平明顯高于癌旁正常組織，提示miR-21在食管癌組織中呈明顯高表達，推測miR-21可能作為促癌基因參與食管癌發(fā)生及發(fā)展過程。進一步分析miR-21的表達與食管癌臨床病理特征間的相關(guān)性顯示，miR-21的表達與食管癌臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示miR-21參與食管癌的發(fā)生及發(fā)展，且隨著食管癌疾病進展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，miR-21表達水平明顯升高。miR-21低表達組生存率明顯高于miR-21高表達組，提示miR-21與食管癌患者預后及5年生存率密切相關(guān)，miR-21有望成為食管癌早期診斷及可靠的預后標志物，與WINTHER等[16]研究結(jié)果一致。Spearman秩和檢驗結(jié)果顯示，食管癌組織中miR-203與miR-21表達呈明顯負相關(guān)，推測二者可能存在某種調(diào)控關(guān)系，共同參與食管癌的發(fā)生及發(fā)展過程，其具體作用機制后續(xù)試驗將進一步深入探究。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-203在食管癌組織中呈明顯低表達，miR-21呈明顯高表達，二者有望成為食管癌早期診斷及預后判斷的有效標志物，具有較高的研究價值。

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