李 旺，倪 萍，周成林

(江蘇省泰州市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 225300)

病毒宏基因組學(xué)方法在病毒學(xué)研究方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，它既能夠檢測(cè)標(biāo)本中的已知病毒，又能夠檢測(cè)標(biāo)本中的未知病毒。目前，病毒宏基因組學(xué)方法已得到廣泛應(yīng)用。KRABERGER等[1]應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法從污水處理池發(fā)現(xiàn)了許多新的單鏈環(huán)形DNA病毒。楊凡力等[2]同樣應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法在蝙蝠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)腺病毒、圓環(huán)病毒、細(xì)小病毒、博卡病毒等新病毒。ZHANG等[3]應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法在牛肉中檢測(cè)與感染靈長(zhǎng)類多瘤病毒親緣關(guān)系最近的牛多瘤病毒(BPyV2-SF)。用病毒宏基因組學(xué)方法對(duì)腹瀉兒童及健康兒童的糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腹瀉標(biāo)本中主要存在指環(huán)病毒、杯狀病毒和Salivirus,而正常兒童糞便標(biāo)本中最多的病毒依次為指環(huán)病毒、Tymovirus和人雙埃可病毒。此外，兩組標(biāo)本中病毒序列數(shù)量相差甚遠(yuǎn)，并且首次在中國(guó)兒童腹瀉糞便標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了第4基因群型(諾如病毒)。應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法對(duì)兒童呼吸道標(biāo)本和腦脊液樣本進(jìn)行研究顯示，不同標(biāo)本及不同健康狀態(tài)下病毒群體的組成存在一定差異。丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一種傳染性疾病，全球有1.3～2.1億人感染HCV并轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥菊撸瑢?duì)人類的健康造成嚴(yán)重威脅[4]。因此，進(jìn)行HCV致病機(jī)制及相關(guān)性研究對(duì)于預(yù)防和治愈丙型肝炎有重要意義。本研究應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法對(duì)HCV-RNA陽(yáng)性血清標(biāo)本進(jìn)行研究，以了解HCV-RNA陽(yáng)性血清樣本中病毒群落的組成，并與健康人群血清病毒群落的組成進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)二者之間病毒組成的差異性，為探索和研究與丙型肝炎相關(guān)的其他病毒提供前期研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1標(biāo)本采集 選取2015年4月至2016年7月泰州市人民醫(yī)院收集的30份HCV-RNA陽(yáng)性患者血清標(biāo)本，男、女性各15份；另選取10份健康人群血清標(biāo)本，男、女性各5份。

1.2標(biāo)本分組設(shè)計(jì) 考慮到構(gòu)建病毒文庫(kù)成本較高，本研究根據(jù)性別及病毒載量將每10份標(biāo)本作為一組，各組內(nèi)每份標(biāo)本取150 μL混合制成混合液，構(gòu)成4個(gè)標(biāo)本文庫(kù)。詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 標(biāo)本組合信息

1.3核酸酶消化 在4支1.5 mL的無(wú)RNA酶離心管內(nèi)分別加入10×Buffer Cocktail 20 μL、Cocktail of DNases 7 μL、 Micrococcal Nuclease 5 μL、RNase A 2 μL及混合血清166 μL，混勻后37 ℃ 反應(yīng)60 min，反應(yīng)至30 min時(shí)輕輕混勻幾次使反應(yīng)充分。

1.4病毒核酸提取 采用病毒核酸提取對(duì)核酸酶消化處理后的標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸提取，最后病毒核酸溶于50 μL buffer AVE中再加入0.5 μL RNA酶抑制劑，混勻冰上放置待用。

1.5反轉(zhuǎn)錄及合成雙鏈DNA 應(yīng)用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取4支無(wú)RNA酶的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)管分別加入dNTP(10 nmol/L)1 μL、含接頭的6堿基隨機(jī)引物(100 μmol/L) 1 μL、RNA 1 μL，渦旋混勻后瞬時(shí)離心后置于PCR儀上，65 ℃ 反應(yīng)5 min，迅速置于冰上>2 min。隨后向各管中分別加入Buffer Cocktail 4 μL、ScriptⅢ?RT Enzyme Mix Ⅰ 1 μL、DTT 1 μL,渦旋混勻后瞬時(shí)離心后，于25 ℃ 10 min、50 ℃ 60 min、85 ℃ 5 min、95 ℃ 2 min后迅速置于冰上放置≥2 min。再向各反應(yīng)管中加入Klenow酶1 μL，渦旋混勻后瞬時(shí)離心，置于PCR儀上進(jìn)行37 ℃ 60 min，75 ℃ 20 min反應(yīng)。最后將得到的雙鏈DNA產(chǎn)物保存待用。

1.6構(gòu)建病毒文庫(kù) 取4支無(wú)RNA酶的PCR管分別加入10 μL TD buffer、5 μL ATM及5 μL雙鏈DNA，混勻后2 100 r/min離心1 min后置于PCR儀上進(jìn)行55 ℃、5 min反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后當(dāng)溫度降至10 ℃時(shí)迅速向每管中加入5 μL NT buffer，混勻，2 100 r/min離心1 min。隨后分別轉(zhuǎn)移至4個(gè)預(yù)先分別加有Illumina index primer(5 μL N primer和5 μL S primer)和15 μL NPM buffer的混合液中混勻，2 100 r/min離心1 min，置于PCR儀上進(jìn)行72 ℃ 3 min、95 ℃ 30 s、94 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共15個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min反應(yīng)，即得到病毒文庫(kù)。

1.7篩選DNA片段 使用Qiaquick公司生產(chǎn)的PCR核酸純化試驗(yàn)盒純化病毒文庫(kù)以去除引物二聚體。隨后利用Ampure磁珠(Beads)對(duì)病毒文庫(kù)DNA長(zhǎng)度進(jìn)行篩選：取4支1.5 mL離心管分別向各管加入30 μL文庫(kù)DNA和27 Beads，加樣槍上下輕輕混勻，室溫靜置5 min，隨后再置于磁力架上5 min后吸棄上清液。再向管內(nèi)加入80%乙醇溶液500 mL的洗滌Beads，洗滌2次后吸棄乙醇溶液，打開(kāi)管口室溫靜置5 min，使乙醇完全揮發(fā)。隨后從磁力架上取下離心管加入30 μL無(wú)菌水，加樣槍上下輕輕混勻，靜置2 min。再將離心管置于磁力架上靜置3 min,吸取20 μL上清液于0.2 mL的PCR管中用于Miseq測(cè)序。

1.8Miseq深度測(cè)序及生物信息學(xué)分析應(yīng)用 Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行Miseq深度測(cè)序，隨后將測(cè)序原始數(shù)據(jù)傳至美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校，通過(guò)其病毒宏基因組學(xué)分析平臺(tái)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。應(yīng)用Bowtie 2軟件濾除數(shù)據(jù)中真核及原核基因組序列。再應(yīng)用Phred、VecScreen CAP3、meta-Velvet、ABySS和SOAPdenovo 2等一系列軟件實(shí)施序列尾部剪切、引物序列和接頭去除、序列拼接等操作。隨后將序列放入本地病毒蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTx搜索。再將所有可能為病毒基因的核酸序列放在平臺(tái)內(nèi)的NVNR蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTx搜索，最后篩選出病毒核酸序列。

2 結(jié) 果

2.1各文庫(kù)中病毒群落組成 對(duì)4個(gè)病毒文庫(kù)中病毒群落序列進(jìn)行整理，文庫(kù)HCV01、HCV02、HCV03、HCV04中病毒群落構(gòu)成見(jiàn)圖1～4。數(shù)據(jù)顯示，HCV01文庫(kù)中總病毒序列數(shù)為1 514條，主要由黃病毒科(Flaviviridae)48%、指環(huán)病毒科(Anelloviridae)29%、未分類科病毒(None)8%、反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)7%、微小噬菌體科(Microviridae)2%構(gòu)成；HCV02文庫(kù)中總病毒序列數(shù)為2 820條，主要由Anelloviridae 61%、Flaviviridae 18%、Retroviridae 8%、None 3%、Microviridae 1%構(gòu)成；HCV03文庫(kù)中總病毒序列數(shù)為3 539條，主要由Anelloviridae 78%、None 5%、Flaviviridae 4%、Retroviridae 4%、人類內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒科(HERV)2%、Microviridae 1%構(gòu)成；HCV04文庫(kù)中總病毒序列數(shù)為3 549條，主要由Anelloviridae 90%、None 4%、Retroviridae 2%、藻類脫氧核糖核酸病毒科(Phycodnaviridae)1%、其他病毒科1%構(gòu)成。

圖1 HCV01病毒群落構(gòu)成

圖2 HCV02病毒群落構(gòu)成

圖3 HCV03病毒群落構(gòu)成

圖4 HCV04病毒群落構(gòu)成

2.2HCV序列檢測(cè) HCV01和HCV03文庫(kù)中分別檢測(cè)到的719條、138條Flaviviridae序列均為HCV序列；HCV02文庫(kù)中檢測(cè)到的515條Flaviviridae序列中有504條為HCV序列，11條為瘟疫病毒(Pegivirus)；HCV04文庫(kù)中檢測(cè)到的3條Flaviviridae序列均為Pegivirus。

2.3各文庫(kù)中病毒群落構(gòu)成比較 見(jiàn)表2。

表2 各文庫(kù)中病毒群落構(gòu)成比較(n)

3 討 論

傳統(tǒng)研究病毒的方法具有一定的局限性，如PCR只能擴(kuò)增已知病毒或低變異病毒，而高變異病毒及未知序列病毒此法則難以實(shí)施；血清學(xué)方法則難以獲得新病毒的特異抗體；細(xì)胞培養(yǎng)法，很多病毒缺乏特異的細(xì)胞系及大多數(shù)病毒不能進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。病毒宏基因組學(xué)專注于病毒群體，能夠檢測(cè)標(biāo)本中已知和未知病毒再發(fā)現(xiàn)新病毒，在檢測(cè)病毒流行情況方面展現(xiàn)出強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。

本研究應(yīng)用病毒宏基因組學(xué)方法對(duì)江蘇省泰州地區(qū)健康者及HCV-RNA陽(yáng)性患者血清病毒群落組成進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，4個(gè)病毒文庫(kù)中Flaviviridae序列水平由多至少分別是HCV01、HCV02、HCV03、HCV04，該結(jié)果與HCV-RNA檢測(cè)結(jié)果相符。文庫(kù)HCV04為健康對(duì)照組，該文庫(kù)中僅檢測(cè)到3條Flaviviridae序列為Pegivirus；4個(gè)文庫(kù)中總病毒序列數(shù)及Anelloviridae病毒序列數(shù)由多至少分別是HCV04、HCV03、HCV02、HCV01，這可能是由于血清中高HCV水平抑制了Anelloviridae病毒的復(fù)制，從而導(dǎo)致文庫(kù)中Anelloviridae病毒序列水平與HCV水平呈相反現(xiàn)象。4個(gè)文庫(kù)中Anelloviridae病毒序列均占有相當(dāng)大的比例，除文庫(kù)HCV01外，其他3個(gè)文庫(kù)中Anelloviridae病毒序列數(shù)最多，說(shuō)明正常情況下Anelloviridae病毒是構(gòu)成血液中病毒群落的主體。

ABUODEH等[5]研究顯示，人類感染Anelloviridae病毒可高達(dá)90%，說(shuō)明人類普遍感染Anelloviridae病毒，可能該病毒科病毒是人體內(nèi)的正常病毒群落。近年來(lái)，一定數(shù)量的新型Anelloviridae病毒被發(fā)現(xiàn)，且這些新型病毒可能與人類的某些疾病有一定關(guān)系。如GALMS等[6]研究顯示，Anelloviridae病毒的一種新型TTMV病毒可能與嚴(yán)重的兒童肺炎有關(guān)；ZHANG等[7]通過(guò)對(duì)患有慢性牙齦炎孕婦的研究發(fā)現(xiàn)了一種新的Anelloviridae，并發(fā)現(xiàn)該病毒可能與牙齦炎的發(fā)生有密切關(guān)系。ALAVI等[8]研究顯示，Anelloviridae與丙型肝炎有一定關(guān)系，但其對(duì)肝臟的影響甚微。本研究中Anelloviridae序列構(gòu)成了病毒文庫(kù)的主體，該病毒科中是否存在一些新型的并與疾病相關(guān)的病毒還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，丙型肝炎患者血清中是否存在與疾病相關(guān)的其他未知的病毒還需要今后的深入研究。

目前病毒宏基因組學(xué)已廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng)域，但還存在很多技術(shù)難題和缺陷。(1)標(biāo)本過(guò)濾處理時(shí)導(dǎo)致病毒顆粒的丟失[9]。(2)核酸酶不能完全消化游離核酸，從而增加了測(cè)序成本及對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析的難度[10]。(3)目前病毒宏基因組學(xué)方法成本高、歷時(shí)長(zhǎng)，作為緊急檢測(cè)方法應(yīng)用于臨床檢測(cè)還有很大難度。(4)一次測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)有限，如標(biāo)本量較多，就會(huì)導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)據(jù)被掩蓋；反之，如標(biāo)本量較少，則增加了測(cè)序成本。相信隨著科技的不斷進(jìn)步，以上技術(shù)難題將會(huì)逐步得以解決，病毒宏基因組學(xué)技術(shù)將來(lái)一定能夠成為臨床上的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，更好地為人類的健康生活服務(wù)。

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