胡朝恩，鐘大鵬，艾智華△

(1.四川省攀枝花市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 617000；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院內(nèi)分泌科，成都 610083)

糖尿病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)高速增長，已嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量；糖尿病是胰島素相對或絕對缺乏引起碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂，以血漿葡萄糖升高為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，也有學(xué)者稱之為“糖脂病”[1]。Toll樣受體(TLRs)是最重要的一類模式識別受體，可選擇性識別病原相關(guān)分子模式，激活天然免疫系統(tǒng)，構(gòu)成抵御病原微生物入侵的第一道屏障。有研究發(fā)現(xiàn)，Toll受體2(TLR2)的激活能夠介導(dǎo)上調(diào)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)，誘導(dǎo)胰島炎癥，導(dǎo)致胰島素抵抗[2]；TLR4水平的升高參與調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能障礙[3]；而抑制或基因敲除小鼠體內(nèi)的TLR2和Toll受體4(TLR4)受體能預(yù)防2型糖尿病發(fā)生胰島素抵抗，減弱糖尿病和早期糖尿病腎病的輕度炎癥狀態(tài)。主要表達(dá)于胰腺組織細(xì)胞內(nèi)的Toll受體3(TLR3)，能識別組織細(xì)胞損傷、凋亡釋放的內(nèi)源性產(chǎn)物[4]。主要通過Toll/IL-1受體接頭蛋白分子(TRIF)途徑激活信號分子核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)、干擾素調(diào)節(jié)因子-3(IRF-3)等，引起局部細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥[5]。本研究旨在探討高糖高脂對胰島β細(xì)胞的損傷及機(jī)制，觀察TLR3、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6、CRP、補(bǔ)體C3及補(bǔ)體C4的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗(yàn)細(xì)胞 小鼠胰島β細(xì)胞株(NIT-1)購于上海拜力生物科技有限公司。

1.1.2試劑 細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Gibeo公司，CCK-8 檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；胰島素放免試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所；棕櫚酸(PA)購自美國Sigma 公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP，補(bǔ)體C3、C4購自美國eBioscience公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1高糖、高脂培養(yǎng)基制備和細(xì)胞模型建立

1.2.1.1高糖、高脂培養(yǎng)基制備 (1)高脂培養(yǎng)基制備：高脂培養(yǎng)基中含棕櫚酸0.25 mmol/L，具體方法：取10 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液溶解51.3 mg棕櫚酸配制成20 mmol/L的棕櫚酸母液；然后取1.67 mL 30%胎牛血清清蛋白與1.25 mL 20 mmol/L的棕櫚酸母液充分混勻，最后再加入含1 mL雙抗溶液95 mL于1640培養(yǎng)基中，充分混勻；(2)高糖培養(yǎng)基制備：高糖培養(yǎng)基中含葡萄糖25 mmol/L，具體方法為100 mL高糖培養(yǎng)基即取90 mL DMEM高糖培養(yǎng)基、10 mL胎牛血清、1 mL雙抗混合。

1.2.1.2細(xì)胞模型建立 NIT-1細(xì)胞待生長至60%～70%融合后，棄原培養(yǎng)基，分別加入高糖、高脂培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h后建立高糖、高脂胰島β細(xì)胞模型。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)、傳代和分組 小鼠NIT-1培養(yǎng)于含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基中，隔天換液。根據(jù)細(xì)胞密度按1∶(1～3)的比例傳代。待細(xì)胞數(shù)量足夠時(shí)取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)分組：正常組(C組)、高糖組[G組，含葡萄糖(Glucose) 25 mmol/L]、高脂組(Z組，含PA 0.25 mmol/L)、高糖高脂組(GZ組，含Glucose 25 mmol/L和PA 0.25 mmol/L)。

1.2.3細(xì)胞活力檢測 取對數(shù)生長期密度約為80%～90%的NIT-1細(xì)胞，用適量稀釋的0.25%胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，按每孔7×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為C組、G組、Z組和GZ組，分別給予完全培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基、高脂培養(yǎng)基和高糖高脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。采用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活力；CCK-8試劑盒是基于WST-8[2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽]廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的一種快速高靈敏度檢測試劑盒，水溶性四唑鹽WST-8在電子載體1-Methoxy PMS作用下，可被細(xì)胞線粒體中的一些脫氫酶還原成水溶性橙黃色甲臜染料，顏色深淺與細(xì)胞增殖呈正比，與細(xì)胞毒性呈反比；細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深，而細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺；對于同樣的細(xì)胞，顏色深淺和細(xì)胞數(shù)目呈良好線性關(guān)系；使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的OD值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

1.2.4TLR3 mRNA檢測

1.2.4.1總RNA提取 (1)吸取培養(yǎng)液，使用預(yù)冷1×磷酸鹽緩沖液(PBS )清洗2次；(2)按試劑盒推薦最佳劑量，向培養(yǎng)細(xì)胞中加入適量的裂解液Buffer RL(使用前已加入50×DTT Solution溶液)，在水平位置輕輕搖晃，使裂解液均勻分布于細(xì)胞表面，以便充分裂解細(xì)胞，然后使用移液槍反復(fù)吹打細(xì)胞，使其脫落；(3)將內(nèi)含細(xì)胞的裂解液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，裂解液室溫靜置2 min；(4)將去gDNA吸附柱安放到2 mL的Collection Tube上，將裂解液轉(zhuǎn)移到去gDNA吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，棄去gDNA吸附柱，保留2 mL Tube 中的濾液；(5)加入與液體等體積的 70%乙醇，使用移液槍將溶液混合均勻，立即將混合液(含沉淀)全部轉(zhuǎn)入到RNA Spin Column(含2 mL Collection Tube)中，12 000 r/min離心1 min，棄濾液；(6)將 RNA Spin Column 放回到 2 mL Collection Tube 中，將500 μL 的Buffer RWA 加入至RNA Spin Column中，12 000 r/min離心30 s，棄濾液；(7)將含等體積100%乙醇的600 μL Buffer RWB沿管壁四周加入至RNA Spin Column中，12 000 r/min離心30 s，棄濾液，再重復(fù)本操作1次；(8)將RNA Spin Column 重新安置于2 mL Collection Tube上，12 000 r/min 離心2 min，再將RNA Spin Column 安置于1.5 mL的RNase Free Collection Tube上，向RNA Spin Column 膜中央處加入50～200 μL的0.1% DEPC處理水，室溫靜置5 min；(9)12 000 r/min 離心2 min洗脫 RNA。

1.2.4.2紫外定量和檢測 先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1∶100)后，讀取其在分光光度計(jì)260 nm和280 nm處的OD值，測定RNA溶液的濃度和純度。

1.2.4.3相關(guān)引物合成 按照Genebank 給出的基因序列，設(shè)計(jì)小鼠TLR3 mRNA引物，引物系列：上游，5′-TCA CTT GCT CAT TCT CCC TT-3′，157 bp；下游，5′-GAC CTC TCC ATT CCT GGC-3′。

1.2.4.4RT-PCR 嚴(yán)格按照TaKaRa的One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)DRR066A試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5IL-1β、IL-6、TNF-α、CRP及補(bǔ)體C3、C4檢測 取對數(shù)生長期密度為80%～90%的NIT-1細(xì)胞，用適量稀釋的0.25%胰蛋白酶消化為單細(xì)胞懸液，按每孔7×103個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞分為C組、G組、Z組和GZ組，分別給予完全培養(yǎng)基、高糖培養(yǎng)基、高脂培養(yǎng)基和高糖高脂培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞上清液，分別檢測TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP及補(bǔ)體C3、C4的表達(dá)。本試驗(yàn)采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定各檢測指標(biāo)，具體操作嚴(yán)格按照ELISA說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1高糖高脂抑制胰島β細(xì)胞增殖 與C組比較，G組、Z組及GZ組胰島β細(xì)胞增殖水平明顯受到抑制，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且胰島β細(xì)胞增殖情況呈C組向G組、Z組、GZ組逐漸下降的趨勢，G組胰島β細(xì)胞增殖率低于C組，GZ組又低于G組和Z組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但G組與Z組胰島β細(xì)胞增殖率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。可見糖脂毒性協(xié)同抑制胰島β細(xì)胞增殖的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單獨(dú)的高糖或高脂作用(圖1)。

圖1 各組胰島β細(xì)胞活力比較(以O(shè)D值表示)

2.2高糖高脂誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞TLR3、TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP、補(bǔ)體C3及補(bǔ)體C4過表達(dá)

2.2.1TLR3表達(dá)情況 與C組比較，各組胰島β細(xì)胞TLR3 mRNA的表達(dá)明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GZ組TLR3 mRNA的表達(dá)明顯高于其他各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而Z組與GZ組TLR3 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖脂協(xié)同作用產(chǎn)生的毒性作用明顯高于高糖、高脂的單獨(dú)作用(圖2)。

圖2 各組TLR3 mRNA表達(dá)情況(以O(shè)D值表示)

2.2.2TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP、補(bǔ) 體C3及補(bǔ)體C4表達(dá)情況 見表1。由表1可見,G組、Z組、GZ組TNF-α的表達(dá)明顯高于C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而G組、Z組、GZ組間TNF-α的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；經(jīng)高糖、高脂處理后，各組胰島β細(xì)胞IL-1β和IL-6的表達(dá)均明顯增加,與C組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CRP在各組表達(dá)均明顯高于C組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且G組和GZ組CRP水平明顯高于Z組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過高糖、高脂處理后，各組胰島β細(xì)胞表達(dá)補(bǔ)體C3與C4水平均明顯高于C組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP、補(bǔ)體C3及補(bǔ)體C4表達(dá)情況(以O(shè)D值表示)

3 討 論

糖尿病與免疫炎癥的關(guān)系最早有學(xué)者于1993年在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。之后許多研究也證實(shí)，糖尿病患者血清中各種炎癥標(biāo)志物水平較對照者明顯增加，如IL、CRP、TNF-α等[6-8]；在糖耐量減低或受損階段就存在炎癥因子水平的變化，慢性低水平的持續(xù)性炎癥可能是糖尿病持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵?！把装Y與糖尿病”的關(guān)系已成為全球內(nèi)分泌學(xué)者共同關(guān)注的熱點(diǎn)。無論1型糖尿病還是2型糖尿病，都是一種機(jī)體系統(tǒng)性輕度炎癥狀態(tài)，而這種輕度炎癥狀態(tài)來源于內(nèi)源性和外源性配體刺激先天免疫細(xì)胞產(chǎn)生和分泌前炎癥因子[9]。目前普遍認(rèn)為,糖尿病是由細(xì)胞因子介導(dǎo)的一種自身免疫和慢性低度炎性疾病，表現(xiàn)為一些非特異性的炎性標(biāo)志物水平升高，包括免疫炎癥細(xì)胞(如白細(xì)胞)、急性期反應(yīng)蛋白(如CRP)、細(xì)胞因子(如TNF-α、IL系列)、脂肪因子、補(bǔ)體系統(tǒng)和細(xì)胞黏附分子等[10-11]。

有研究證實(shí)，炎癥標(biāo)志物參與了糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，但具體作用機(jī)制還尚待研究[12-13]。TNF-α、IL-6及CRP是目前公認(rèn)的敏感的亞臨床炎癥標(biāo)志物[14]。CRP是主要的急性時(shí)相蛋白，主要由TNF-α、IL-6等刺激肝臟產(chǎn)生，具有免疫識別和調(diào)節(jié)功能，能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，進(jìn)一步釋放炎癥介質(zhì)，加劇免疫炎癥，如此形成一個(gè)反饋循環(huán)[15]。炎癥可減少周圍組織對葡萄糖的利用，降低β細(xì)胞對葡萄糖的敏感性，誘導(dǎo)胰島素抵抗，抑制胰島β細(xì)胞生長和分化，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡和功能障礙，最終導(dǎo)致胰島素分泌相對或絕對不足。

本研究應(yīng)用高糖、高脂刺激后發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞大量表達(dá)TLR3 mRNA、TNF-α、IL-1β、IL-6、CRP及補(bǔ)體C3、C4，誘導(dǎo)β細(xì)胞炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞增殖和胰島素分泌受到明顯抑制。高糖、高脂環(huán)境下TLR3過量表達(dá)，在受到內(nèi)、外源性配體刺激后，激活TLR3信號通路，主要通過TRIF途徑完成一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使NF-κB和IRF-3活化，最終導(dǎo)致多種炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)合成和釋放，TNF-α、IL-6、IL-1β又促進(jìn)CRP 生成，而CRP能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，誘導(dǎo)補(bǔ)體C3、C4增加，進(jìn)一步釋放炎癥介質(zhì)，加劇免疫炎癥，如此形成一個(gè)反饋循環(huán)；抑制胰島β細(xì)胞的生長活力和胰島素分泌，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡和功能障礙，最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，糖尿病的發(fā)生和發(fā)展可能是糖脂代謝紊亂和慢性免疫炎癥等多因素共同作用的結(jié)果，而且這些因素可能在血糖調(diào)節(jié)受損階段就已出現(xiàn)。糖脂代謝紊亂與慢性低度炎癥有極為密切的關(guān)系；長期高糖、高脂刺激會(huì)誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，引發(fā)β細(xì)胞的慢性免疫炎癥，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的損傷和功能障礙，抑制胰島素分泌和β細(xì)胞增殖，造成胰島素分泌相對或絕對缺乏；慢性免疫炎癥又反過來加劇糖脂代謝進(jìn)一步紊亂，最終二者共同促進(jìn)糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

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