韓如月，楊 帆，李睿瑞，劉淑霞，張千豐，王麗艷，郭永霞

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163319；3.深圳市鐵漢生態(tài)環(huán)境股份有限公司，廣東深圳 518000）

木醋液（Wood vinegar）是由木材、木屑、樹枝、樹葉、秸稈等一些農(nóng)林廢棄物熱解碳化的過程中產(chǎn)生的氣體，經(jīng)過冷凝回收再分離得到的有機(jī)液體。其主要成分比較復(fù)雜，主要成分為酸類、醛類、酮類和酚類，還有酯類、醇類、胺類、吡啶，以及K，Ca，F(xiàn)e，Mg，Zn，Mn，Ge 等微量元素[1]。因其不產(chǎn)生二次污染[2]，材料隨處可見，可變廢為寶，而且都是可再生資源，成本低廉、加工方法簡(jiǎn)單、節(jié)約能源，經(jīng)濟(jì)效益可觀[3]。木醋液在促進(jìn)作物生長(zhǎng)、土壤改良、防蟲抑菌和果蔬保鮮等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域均有很好的研究進(jìn)展[4]。有關(guān)研究表明，從蘋果樹干和蘋果葉中制得的木醋液具有抗氧化作用。皮膚保健和豬飼料[5-7]等方面也有涉及。在傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，日本農(nóng)民普遍使用木醋液防治作物、果樹病害和土傳病害，效果明顯[8-10]，也可作為保鮮劑使用[11-12]。木醋液的研究與開發(fā)將對(duì)國(guó)家經(jīng)濟(jì)、能源、環(huán)保等方面的發(fā)展起促進(jìn)作用，具有極大的發(fā)展前景[13]。

由于木醋液來自于農(nóng)林廢棄物炭化的副產(chǎn)品，是天然無害的植物源農(nóng)藥，具有不污染環(huán)境、對(duì)人畜安全、特異性高、防效好、安全無害、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)利用木醋液抑制植物病原菌的應(yīng)用較少，也沒有與農(nóng)藥復(fù)配使用的報(bào)道，故試驗(yàn)以木醋液為天然抑菌劑，通過測(cè)定菌落直徑、最低抑菌濃度和真菌的抑菌圈大小，研究木醋液對(duì)植物病原真菌的抑菌效果，通過與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配，研究了木醋液對(duì)植物病原菌的抑菌效果，篩選出與農(nóng)藥混合的最佳配伍，為木醋液在抑菌方面的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 試劑與培養(yǎng)基

木醋液（能邇木醋液），購(gòu)自當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)；農(nóng)藥惡霉靈，威海韓浮生化藥業(yè)有限公司提供；1%和1.5%PDA培養(yǎng)基。

1.2 供試菌株

供試菌株，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。具體如下：

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、半裸鐮刀菌（Fusarium graminearum）、禾谷鐮刀菌 （Fusarium graminearum Schw）、串珠鐮刀菌 （Fusarium verticillioides）、茄鏈格孢菌（Alternaria solani）、玉米鏈格孢菌 （Alternaria tenuis Nees）、玉米新月彎孢菌（Curvularia lunata）、立枯絲核菌 （Rhizoctonia solanikuhn）、大豆菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bar）、稻瘟病菌（Magnapporthe grisea）、甜瓜枯萎病菌（F.oxysprum f.sp.melonis）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、禾頂囊殼菌（Gaeumannomyces graminis）。

1.3 主要儀器

超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、牛津杯、鑷子、打孔器、接種針、滅菌鍋等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 木醋液與植物病原菌的對(duì)峙試驗(yàn)

2.1.1 不同體積濃度木醋液的制備

木醋液濃度為 1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5μL/mL的制備：取5個(gè)1.5mL離心管中依次加入900 μL無菌水，往第1個(gè)離心管中加入100 μL木醋液原液，混勻后再?gòu)牡?個(gè)離心管中取100 μL加入第2個(gè)離心管中，以此類推直至第5個(gè)離心管，此時(shí)木醋液濃度依次為0，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5μL/mL。

2.1.2 不同體積濃度木醋液的抑菌試驗(yàn)

（1） 雙層平板的制備。向直徑90 mm培養(yǎng)皿中先倒入1.5%固體PDA培養(yǎng)基5 mL，凝固后再倒入1%固體PDA培養(yǎng)基15 mL，待其凝固。

（2） 牛津杯法（也稱管碟法）。用5 mm打孔器在真菌邊緣打好菌碟，用接種針挑到雙層平板中央處，置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待真菌的菌絲長(zhǎng)至半徑約為1.5 cm時(shí)，用鑷子在菌碟周圍半徑約為3.5 cm處均勻放置滅菌的牛津杯，輕輕按壓但不要戳破培養(yǎng)基，再吸取不同濃度木醋液各200 μL順時(shí)針加入牛津杯的濃度分別為0，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5μL/mL，做 3 次重復(fù)。菌碟周圍不加牛津杯為對(duì)照組1，菌碟周圍加牛津杯不加木醋液為對(duì)照組2。置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對(duì)照組菌絲半徑長(zhǎng)到3.5 cm時(shí)，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。

抑菌圈半徑=對(duì)照組菌絲半徑-抑菌邊緣半徑.

計(jì)算各處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率：

試驗(yàn)中使用的所有儀器均用滅菌鍋121℃滅菌30 min。

2.2 木醋液與農(nóng)藥復(fù)配的植物病原菌的對(duì)峙試驗(yàn)

選擇對(duì)多種植物病原菌抑制效果最好的1×10-1μL/mL的木醋液與化學(xué)農(nóng)藥原藥稀釋3 000倍的惡霉靈進(jìn)行復(fù)配。同2.2中的方法制備雙層平板，待真菌的菌絲長(zhǎng)至半徑約為1.5 cm時(shí)，用鑷子在菌碟周圍半徑約為3.5 cm處均勻放置滅菌的牛津杯，輕輕按壓但不要戳破培養(yǎng)基，在雙層平板最上方的牛津杯中加入200 μL的無菌水，順時(shí)針依次加入200μL的木醋液與農(nóng)藥，比例依次為10∶0，9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9，0∶10，做3次重復(fù)。置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對(duì)照組菌絲半徑長(zhǎng)到3.5cm時(shí)，觀察并測(cè)量抑菌圈大小。

抑菌圈半徑=照組菌絲半徑-抑菌邊緣半徑.

計(jì)算各處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率：

2.3 數(shù)據(jù)分析

采用單因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果的方差分析利用Duncan's法分析數(shù)據(jù)之間的差異性。

3 結(jié)果與分析

3.1 木醋液對(duì)植物病原菌的抑菌效果

不同稀釋倍數(shù)木醋液對(duì)植物病原菌的抑制作用見表1。

表1 不同稀釋倍數(shù)木醋液對(duì)植物病原菌的抑制作用

從表1可以看出，稀釋10倍的木醋液對(duì)立枯絲核菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮刀菌、玉米鏈格孢菌這4種病原菌的抑菌圈較大，且在0.05水平上效果顯著，有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)照組2無抑菌圈，說明牛津杯對(duì)其無抑制作用；稀釋1 000倍的木醋液對(duì)玉米新月彎孢菌的抑菌圈較大，且在0.05水平上效果顯著，有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)照組2無抑菌圈，說明牛津杯對(duì)其無抑制作用。串珠鐮刀菌和小麥根腐病的每個(gè)木醋液濃度都有抑菌圈，而對(duì)照組2也存在抑菌圈說明牛津杯對(duì)2種病原菌有抑制作用；木醋液對(duì)尖孢鐮刀菌、半裸鐮刀菌、茄鏈格孢菌、甜瓜枯萎病、稻瘟病菌、禾頂囊殼菌這6種病原菌無明顯抑菌圈，鐵環(huán)對(duì)其也沒有抑制作用。說明木醋液對(duì)一些植物病原菌有抑制作用，對(duì)一些植物病原菌沒有作用。

部分植物病原菌與不同稀釋倍數(shù)的木醋液的對(duì)峙試驗(yàn)見圖1。

圖1 部分植物病原菌與不同稀釋倍數(shù)的木醋液的對(duì)峙試驗(yàn)

3.2 木醋液與農(nóng)藥復(fù)配對(duì)植物病原菌的抑菌效果

稀釋10倍的木醋液與稀釋1 000倍的農(nóng)藥惡霉靈，按不同體積比例復(fù)配后對(duì)立枯絲核菌和大豆菌核病菌的抑菌圈和抑菌率。

木醋液與農(nóng)藥復(fù)配對(duì)2種植物病原菌的抑制作用見表2。

從表2可以看出，對(duì)于立枯絲核菌，木醋液與農(nóng)藥的比例在10∶0時(shí)抑菌圈最大，抑菌圈1.7 cm，抑菌率達(dá)到最高85%，與其他配比在0.05水平上具有顯著性，其次是比例為3∶7，抑菌圈1.5 cm，抑菌率達(dá)到75%，比例為7∶3和5∶5時(shí)最小；對(duì)于大豆菌核病菌，木醋液與農(nóng)藥的比例在9∶1時(shí)抑菌圈最大，抑菌圈1.7 cm，抑菌率達(dá)到最高60%，與其他配比在0.05水平上具有顯著性，其次是比例為10∶0和3∶7，抑菌圈為1.1 cm，比例為6∶4和5∶5時(shí)最小。綜合以上結(jié)果，不管是立枯絲核菌還是大豆菌核病菌，都能說明抑菌作用中木醋液能夠起到主要作用，也能起到輔助和減少農(nóng)藥用量的作用。

表2 木醋液與農(nóng)藥復(fù)配對(duì)2種植物病原菌的抑制作用

木醋液與農(nóng)藥復(fù)配與2種病原菌的對(duì)峙試驗(yàn)見圖2。

圖2 木醋液與農(nóng)藥復(fù)配與2種病原菌的對(duì)峙試驗(yàn)

4 結(jié)論與討論

4.1 木醋液對(duì)植物病原菌的抑制作用

目前的研究發(fā)現(xiàn)，木醋液是一種潛在的新型植物抗病肥料，對(duì)多種細(xì)菌、霉菌和植物病原真菌都有抑制作用[14-22]，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣桿菌[14]等細(xì)菌，黑曲霉、康氏木霉[14]、總狀毛霉、黑根霉[15]、穿地龍霉菌[16]等霉菌，棉花黃萎病菌以及黃瓜炭疽病菌[17-18]、棉花枯萎病菌[19]、馬鈴薯晚疫病菌[20]、花生網(wǎng)斑病菌和黑斑病菌[21]等多種病原真菌。

李燕等人[22]發(fā)現(xiàn)木醋液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.60%時(shí)對(duì)禾谷鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到83.78%[22]，出現(xiàn)這種差異可能是由于木醋液的成分不同，有效抑菌物質(zhì)濃度有所差異導(dǎo)致，不同原料的木醋液對(duì)植物病原菌的抑制作用不同[19]。馬良進(jìn)等人[23]的研究結(jié)果表明，單純竹醋液稀釋液與對(duì)照相比均有不同程度的抑菌作用。

盡管人們對(duì)木醋液具有廣譜性殺菌作用的觀點(diǎn)已達(dá)成共識(shí)，但試驗(yàn)結(jié)果表明木醋液并不是對(duì)所有植物病原菌均有抑制作用。不同稀釋倍數(shù)的木醋液對(duì)植物病原菌的抑制作用不同，木醋液稀釋10倍，對(duì)植物病原菌的抑菌效果最好，對(duì)立枯絲核菌、大豆菌核病菌、禾谷鐮刀菌、玉米鏈格孢菌均有抑制作用，稀釋1 000倍對(duì)玉米新月彎孢菌有抑制作用。

4.2 木醋液與惡霉靈復(fù)配對(duì)植物病原菌的抑制作用

植物真菌病害是近年來嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的微生物病害。目前，防治真菌病害的措施主要還是化學(xué)防治，而化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用帶來了一系列的問題，導(dǎo)致的農(nóng)業(yè)面源污染問題[24]。引起農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染等問題，如何減少化學(xué)農(nóng)藥的副作用，成為當(dāng)前關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

惡霉靈是廣譜性殺菌劑，對(duì)多種病原真菌引起的植物病害有較高的防治效果，比如一些土壤真菌、鐮刀菌、根殼菌、絲核菌、腐霉菌、苗腐菌、伏革菌等病原菌。故選擇惡霉靈為農(nóng)藥復(fù)配對(duì)象，意在代替或減少農(nóng)藥惡霉靈的使用。王獻(xiàn)慧等人[25]也發(fā)現(xiàn)硫磺多菌靈與惡霉靈2種殺菌劑的不同比例混劑對(duì)蓮藕腐敗病菌均有抑制作用，其抑菌效果與單劑相比，均表現(xiàn)為增效作用。魏琦等人[26]研究表明，竹醋液對(duì)蘋果腐爛菌、蘋果炭疽菌和番茄灰霉菌的抑菌作用較強(qiáng)，竹醋液對(duì)咪鮮胺、戊唑醇這2種供試殺菌劑具有增效作用。馬良進(jìn)等人[23]的研究結(jié)果表明，多菌靈1 000倍稀釋液及多菌靈與竹醋液按照1∶3，1∶1和3∶1混配時(shí)，對(duì)鐮刀菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最明顯；多菌靈與竹醋液按照1∶3，1∶1和3∶1混配時(shí)對(duì)絲核菌的抑菌效果最好，均達(dá)到極顯著差異。同樣木醋液與惡霉靈復(fù)配也有相同作用，而且木醋液屬于植物源農(nóng)藥，與化學(xué)農(nóng)藥相比之下無污染，不會(huì)產(chǎn)生抗藥性，是更好的化學(xué)農(nóng)藥替代物。研究表明，木醋液與惡霉靈復(fù)配比單獨(dú)使用惡霉靈效果好，對(duì)其有增效作用，可以減少化學(xué)殺菌劑的用量，從而降低化學(xué)殺菌劑對(duì)食品及環(huán)境安全的不良影響。然而，該結(jié)果是基于室內(nèi)離體活性測(cè)定而得出的結(jié)論，在活體或田間條件下，木醋液是否也具有增效作用，尚待進(jìn)一步研究。

市面上的不同品牌木醋液效果不同，將市場(chǎng)購(gòu)買的能邇木醋液與黑森木醋液同時(shí)做抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，能邇木醋液比黑森木醋液的效果好。初步研究了木醋液離體抑菌機(jī)理，發(fā)現(xiàn)木醋液中的酸性成分對(duì)其離體抑菌活性具有重要作用，稀釋10倍的能邇木醋液pH值可達(dá)3.8，與同pH值的冰醋酸同時(shí)做抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雖然均有抑菌效果，但是能邇木醋液比同pH值的冰醋酸的效果好，故若想將木醋液應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中還需綜合考慮。

[1]劉長(zhǎng)風(fēng)，李敏，高品一，等.木醋液的來源、成分及其應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2016，32（1）：28-32.

[2]徐晴晴，李曉慶，孟雨田，等.木醋液應(yīng)用研究進(jìn)展[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，30（2）：21-23.

[3]全順子，李宗鐵，薛桂新，等．神奇的木醋液和木炭粉[M]．延吉：延邊大學(xué)出版社，2007：11-39.

[4]潘洋.木醋液在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用研究進(jìn)展 [J].現(xiàn)代園藝，2017（11）：34-35.

[5]Sind H M，Zainul A，Z Nur F M.Antioxidant property and chemical profile of pyroligneous acid from pineapple plant wastebiomass[J].ProcessBiochemistry，2015（50）：1985-1 992．

[6]楊國(guó)庭，于學(xué)軍．木醋皮膚保健護(hù)理液及其制作方法：中國(guó)，200510119760．5[P] ．2007-05-09．

[7]潘泰祺．一種木醋液發(fā)酵飼料，中國(guó)，201210101283．X[P]．2012-04-09.

[8]羅鳳來．日本沖繩水稻栽培的一些方法與經(jīng)驗(yàn) [J]．福建農(nóng)業(yè)科技，2001（3）：38-39．

[9]Numata K，Ogawa T，Tanaka K.Effact of pyroligneous acid（wood vinega）ron the several soilborne diseases[J].Proceedings of the Kanto Tosan Plang Protection Society，1994，41 （4）：107-110.

[10]Okada M，Ishii K，Numata K，et al.Can the bilary enhancement Gd-EOB-DTPA predict the degree of licer function[J].Heptobilary Pancreatic Diseases International，2005 （11）：307-313.

[11]薛桂新，陳志軍，李永紅．木醋液對(duì)京亞葡萄保鮮效果的研究 [J]．食品科技，2009，34（12）：46-50．

[12]薛桂新．木醋液對(duì)鮮切百合花的保鮮效應(yīng) [J]．植物生理學(xué)通訊，2008，44（6）：1 140-1 142．

[13]王玉，王小東，黃慧.木醋液的研究進(jìn)展 [J]．安徽林業(yè)科技，2015，41（5）：12-15.

[14]尉芹，馬希漢，朱衛(wèi)紅，等．不同溫度段蘋果枝木醋液化學(xué)組成、抑菌及抗氧化活性比較 [J]．林業(yè)科學(xué)，2009，45 （12）：16-21．

[15]薛桂新，黃世臣，宋益冬．木醋液對(duì)桃黑根霉抑菌作用和對(duì)久保桃保鮮效果的研究 [J]．延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35 （2）：123-130．

[16]張麗萍，史霞，于學(xué)軍．木醋液防治穿地龍霉菌的試驗(yàn)[J]．黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，19（3）：19-20．

[17]毛巧芝，趙忠，馬希漢．杏樹枝木醋液的制取及其抑菌活性和化學(xué)成分分析 [J]．西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，37 （10）：91-96．

[18]毛巧芝，趙忠，馬希漢，等．苦杏殼木醋液抑菌活性和化學(xué)成分分析 [J]．農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2010，41（2）：164-170．

[19]翟梅枝，何文君，王磊，等．3種木醋液化學(xué)成分與抑菌活性研究 [J]．西北植物學(xué)報(bào)，2010，30（6）：1 247-1 252．

[20]馬駿，劉霞，王洪洋，等．木醋液對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用 [J]．中國(guó)馬鈴薯，2011，25（5）：306-308．

[21]石延茂，董煒博，崔鳳高，等．木醋液對(duì)花生網(wǎng)斑病菌和黑斑病菌的毒力測(cè)定 [J]．花生學(xué)報(bào)，2003，32（S）：422-424.

[22]李燕，張玉鳳，林海濤，等.木醋液對(duì)小麥根腐病致病菌及小麥發(fā)芽的影響 [J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，49（4）：96-99，111.

[23]馬良進(jìn)，張昕，陳曉玲，等.竹醋液與殺菌劑混配的抑菌效果 [J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（8）：37-39，45.

[24]金書秦，周芳，沈貴銀，等.農(nóng)業(yè)發(fā)展與面源污染治理雙重目標(biāo)下的化肥減量路徑探析 [J].環(huán)境保護(hù)，2015，（8）：50-53.

[25]王獻(xiàn)慧，梁志懷，魏林，等.硫磺多菌靈和惡霉靈不同比例混配對(duì)蓮藕腐敗病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（23）：71-73.

[26]魏琦，岳永德，湯鋒，等.竹醋液抑菌活性及對(duì)殺菌劑的增效作用 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（13）：6 923-6 925，6 943.◇