褚亞東，劉穎慧，陸洪斌，曹旭鵬，薛 松

（中國科學院大連化學物理研究所海洋生物工程組，大連116023）

1 引言

火星表面的大氣壓平均為600 Pa，是地球氣壓的0.5%；火星表面的溫度變化范圍為－143℃～35℃，火星大氣的主要成分是CO2，占火星大氣的96%；其次是N2，占1.89%；H2O 含量較低，僅占0.03%［1］?；鹦悄壳安皇且粋€生命宜居星球，但火星的資源開發(fā)利用和環(huán)境改造，可使火星形成類地球環(huán)境。目前，NASA科學家于2010年前后提出并被大家所接受的火星移居改造需要經過“加熱、加氣、種樹、種地、生產、蓋房、搬家”七個階段和步驟。在種樹階段，人類可以將某些極端微生物和微藻、苔蘚帶到火星上繁衍［2］。

微藻是空間站中被廣泛深入研究的生物之一，其目的是作為生產者循環(huán)利用系統(tǒng)內的氮、水、CO2等以制取有機物和氧氣，提供給空間站的人［3?5］。 公開報道中，歐美國家合作在國際空間站進行了為期16個月的存活培養(yǎng)測試，最終獲得的兩株微藻，其中有一株為藍藻念珠藻，另一株為綠藻［6］。

發(fā)狀念珠藻（Nostoc flagelliforme），在中國又名“發(fā)菜”，是一種陸生藍藻，生長在干旱、半干旱地區(qū)，具有極強的耐旱性、耐變溫、耐太陽輻射、耐鹽堿和耐貧瘠等生理學特性［7?9］。 此外，發(fā)菜對生存環(huán)境的選擇性很強，干?濕交替的微環(huán)境是其生長發(fā)育的必要條件［10］。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)發(fā)菜在低氣壓（100 Pa、600 Pa、1200 Pa）的長期冷熱頻繁交替條件下仍可以維持生命活動，具有在類火星表面長期生存的可能性［11］。此外，發(fā)菜不僅可以改良荒漠化土壤［7］，且營養(yǎng)豐富，含蛋白質20% ～23%，碳水化合物為57%，粗脂肪為5.6% ～5.7%，其中人體必需的7種氨基酸占總量的35.83%，尤其亮氨酸、蘇氨酸、精氨酸和纈氨酸最為豐富，還可食用，有望成為改造類火星環(huán)境“先鋒植物”的首選［12?13］。 然而，目前并沒有從改造類火星環(huán)境等方面對微藻在類火星的生存條件和可控培養(yǎng)進行研究和探索。

因此，本文擬通過在室內搭建一套在線監(jiān)測模擬類火星環(huán)境密閉體系內發(fā)菜復蘇時放氧速率的試驗裝置，考察不同溫度下氣壓低于和高于相應的水飽和蒸氣壓時對發(fā)菜光合放氧的影響，為微藻改造類火星環(huán)境的應用奠定基礎。

2 材料和方法

2.1 試驗材料

發(fā)菜采自內蒙古阿拉善盟，試驗前已干燥存儲2年。

2.2 發(fā)菜復蘇監(jiān)測放氧裝置的搭建

本文擬考察發(fā)菜在類火星表面半開放體系復蘇的可行性，希望檢測出發(fā)菜在模擬火星氣壓組成，接近火星氣壓（600 Pa）條件下，發(fā)菜光合恢復的極限條件。因此，在試驗設計的時候我們首先考慮的是最低限度保障發(fā)菜能夠有活性，即發(fā)菜復蘇的標準定義為發(fā)菜放氧速率達到發(fā)菜在正常狀態(tài)的1%，即4μmol O2·h－1·g－1（DW） 。

為了模擬類火星環(huán)境低氣壓，我們設計了如圖1所示的試驗裝置原理圖。本系統(tǒng)中使用絕對壓力傳感器替代普通真空壓力表，使壓力顯示更準確，同時可以用于系統(tǒng)內各管路部分體積的標定，附以氣相色譜儀使氧氣濃度的計算更準確。

圖1 發(fā)菜復蘇監(jiān)測放氧裝置原理圖Fig.1 Schematic diagram of the on?line O2 evolution monitoring system for N.flagelliforme recov?ery

通過選用高真空玻璃管，搭建成圖2所示的發(fā)菜復蘇監(jiān)測放氧裝置，通過調節(jié)閥門，在真空泵的抽氣作用下將發(fā)菜培養(yǎng)罐內氣體置換為模擬氣，并可以將氣壓控制在接近火星的氣壓；真空泵可以通過調節(jié)閥門將取樣環(huán)氣體抽出使其接近真空，再調節(jié)三通閥，可將發(fā)菜培養(yǎng)罐內氣體吸至取樣環(huán)內，再調節(jié)閥門，由載氣帶入氣相色譜進行檢測。

2.3 發(fā)菜復蘇培養(yǎng)條件

圖2 發(fā)菜復蘇監(jiān)測放氧裝置圖Fig.2 Set?up of the on?line O2 evolution monitoring system for N.flagelliforme recovery

發(fā)菜生長于干旱、半干旱地區(qū)，水分是其生長的主要限制因子。自然條件下，雨水、露水和霧氣是其生長所需水分的主要來源，環(huán)境水分條件是發(fā)菜生存生長的關鍵性因子［10］。干燥發(fā)菜能從相對濕度高于28.4%的環(huán)境空氣中吸取水分。而火星環(huán)境中氣壓為 600 Pa，氣態(tài)水也不足0.03%。因此，為了考察發(fā)菜復蘇時所需最低氣態(tài)水，我們在選擇氣壓的時候將在不同溫度條件下氣壓和蒸氣壓對應，目的是希望檢測發(fā)菜在接近火星低氣壓條件下，發(fā)菜復蘇的極限條件，而本試驗設計的難度在于很難穩(wěn)定控制體系內的低氣壓。具體培養(yǎng)方法見下：

稱取1 g發(fā)菜，用去離子水清洗3至4次，放在液體BG11 培養(yǎng)基，25℃、40 μmol photons·m－2·s－1下培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)好后，將發(fā)菜用濾紙吸干放在圖2裝置中的發(fā)菜培養(yǎng)罐中，溫度通過循環(huán)水浴分別設定為5℃、15℃、25℃。光照采用LED光源模擬火星光照環(huán)境（由于LED光源亮度易于控制光照從無到有再到不同光強的正弦波變化），光照階段光強以地球地表光強40%（即800 μmol photons·m－2·s－1）為上限呈正弦波變化，光暗比14 h∶10 h。將氣體置換為CO2和N2（體積比為95∶5），通過真空泵抽取真空達到測試壓力，壓力設定依據所對應的水飽和蒸汽壓，如5℃的水飽和蒸汽壓為0.87 kPa，15℃的水飽和蒸汽壓為1.70 kPa，25℃的水飽和蒸汽壓為3.17 kPa。氣態(tài)水狀態(tài)時，氣壓低于相應溫度的水飽和蒸氣壓，而液態(tài)水狀態(tài)時高于相應的水飽和蒸氣壓，具體參數(shù)設定見表1。每個試驗條件做了兩個獨立的重復。

此外，為了驗證含水量是否是影響發(fā)菜在類火星環(huán)境中的重要影響因素，在5℃、氣壓為1.0 kPa以上為液態(tài)水狀態(tài)下，在發(fā)菜培養(yǎng)罐中分別加入5 mL和10 mL BG11液態(tài)培養(yǎng)基進行試驗。

表1 不同溫度下水分狀態(tài)對發(fā)菜復蘇影響試驗設計Table 1 The experiment design of N.flagelliforme re?covery under different water and temperature conditions

2.4 光合放氧速率測定

具體低壓狀態(tài)下發(fā)菜放氧速率測定方法如下：首先設定循環(huán)水浴為試驗溫度，然后打開真空泵，使除培養(yǎng)罐及載氣和氣相部分以外的系統(tǒng)處于真空狀態(tài)，再將預先復蘇的發(fā)菜放入培養(yǎng)罐中，封閉培養(yǎng)罐。將模擬氣源連接至入氣口處，使發(fā)菜培養(yǎng)罐與模擬氣源連通，然后再調節(jié)閥門使真空泵與培養(yǎng)罐連通，將培養(yǎng)罐氣氛置換為模擬氣。再次調節(jié)閥門，使培養(yǎng)罐與模擬氣源斷開，并控制培養(yǎng)罐達到所需氣壓，然后打開LED光源。對于放氧量的測定，以空氣為對照氣。在測定放氧時調節(jié)取樣三通閥，先將取樣環(huán)與真空管路連通，抽真空后再旋轉三通閥與培養(yǎng)系統(tǒng)連通，取樣。然后旋轉三通閥將取樣環(huán)隔離，旋轉進樣四通閥，使進樣環(huán)與載氣管路串聯(lián)，進入氣相色譜。

在進行放氧量測定的過程中，需要先測定氣相色譜峰面積與氧氣摩爾量的關系，如式（1）、（2）所示［14］：

式中，Va為標準空氣的進樣體積，單位L；q為空氣中氧氣百分比，取20.947%；S為標準空氣氧氣峰面積，單位mV·s；Vmol為單位摩爾氣體體積，單位L；Mo為單位峰面積對應的氧氣摩爾量，單位mol；Ta為環(huán)境溫度，單位℃。當已知培養(yǎng)系統(tǒng)容積時，可測得系統(tǒng)內總氧氣摩爾量，如式（3）所示：

式中，Ot為系統(tǒng)內總氧氣摩爾量；As為樣品氣氧氣峰面積；Vt為系統(tǒng)總容積；Vs為進樣環(huán)體積。

通過氮氣色譜峰的增量與空氣中氮氣峰氧氣峰的峰面積比值可以計算得出滲入系統(tǒng)內的氧氣所占的峰面積，如式（4）所示：

式中，Sod為滲入系統(tǒng)的空氣引起的氧氣峰面積增量；Snd為滲入系統(tǒng)的空氣引起的氮氣峰面積增量；So為參比空氣中氧氣峰面積；Sn為參比空氣中氮氣峰面積。

結合式（3）、（4），系統(tǒng)內發(fā)菜釋放的氧氣摩爾量計算如式（5）所示：

式中，Or為發(fā)菜釋放的氧氣摩爾量。

3 結果和討論

3.1 不同溫度和氣壓下水分狀態(tài)對發(fā)菜光合放氧影響

水分是發(fā)菜生理活性的重要限制因子，適宜的水分有助于發(fā)菜維持正常的生理代謝和生長［15?16］。 依據表1的溫度和氣壓設定，分別考察5℃、15℃、和25℃低于和高于相應溫度的水飽和蒸氣壓時對發(fā)菜光合放氧的影響。

3.1.1 25℃不同氣壓下發(fā)菜光合放氧

圖3顯示的是25℃下氣態(tài)水和液態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響。從圖3B中可以看到在反應器溫度為 25℃，氣壓為3.9～4.2 kPa變化范圍內，為液態(tài)水狀態(tài)時，發(fā)菜放氧速率最高時為10 μmol O2·h－1·g－1（DW），是發(fā)菜在正常放氧速率（400 μmol O2·h－1·g－1（DW））的 3%。 但發(fā)菜放氧速率隨著反應時間的延長呈現(xiàn)出先上升后下降再上升的趨勢，這與畢永紅等（2003年）報道一致［16?17］。

為了考察氣態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響，將氣壓調至2.5 kPa（圖3 A）。在最初反應3 h內，氣壓低于3.5 kPa，體系內為氣態(tài)水，放氧速率最高為 7 μmol O2·h－1·g－1（DW）。 由于體系存在水分，水分氣化，很難維持在2.5 kPa，在反應大約3 h 氣壓上升，維持在3.5 ～4.3 kPa，放氧速率呈現(xiàn)下降的趨勢，但是在反應25 h有所上升，此時放氧速率為2.5 μmol O2·h－1·g－1（DW）。通過比較可以得出，在25℃、液態(tài)水狀態(tài)下，發(fā)菜光合放氧能力比在氣態(tài)水狀態(tài)下更高，這驗證了我們所推測的，在火星環(huán)境中，發(fā)菜生存的關鍵因素是水分。

圖3 25℃不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.3 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 25℃

3.1.2 15℃不同氣壓下發(fā)菜光合放氧

圖4顯示的是15℃下不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響。在15℃，氣壓為3.0～4.9 kPa（圖4B），此時水的狀態(tài)為液態(tài)水，發(fā)菜放氧速率最高時為 7 μmol O2·h－1·g－1（DW），比 25℃條件減少了約30%。隨著反應時間的延長，與25℃液態(tài)水條件類似，放氧速率呈現(xiàn)出先下降后上升再下降趨勢。當將氣壓調至1.5 kPa，但是由于體系內在原因導致的壓力變化，氣壓在1.8 kPa左右，反應 1 h，放氧速率為 4.7 μmol O2·h－1·g－1（DW），隨著反應時間的延長，反應4 h后發(fā)菜幾乎是完全干燥狀態(tài)，沒有水分，此時檢測不到放氧速率。這可能是由于發(fā)菜水分完全喪失時，光合作用的終止導致［12］。但是，反應26 h后，放氧速率有所上升，為2.9 μmol O2·h－1·g－1（DW），但是，導致這一現(xiàn)象的原因并不是很清楚。通過比較可以得出，在15℃、液態(tài)水狀態(tài)下，發(fā)菜光合放氧能力比在氣態(tài)水狀態(tài)下更高。

3.1.3 5℃不同氣壓下發(fā)菜光合放氧

圖4 15℃不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.4 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 15℃

當反應器溫度為 5℃，氣壓維持在 1.4～1.6 kPa，為液態(tài)水狀態(tài)時，發(fā)菜放氧的最大速率為5 μmol O2·h－1·g－1（DW）（圖 5 B），與 25℃ 和15℃液態(tài)水條件類似，放氧速率呈現(xiàn)出先下降后上升再下降趨勢。當氣壓調至0.9～1.0 kPa，為氣態(tài)水狀態(tài)時（圖5 A），發(fā)菜的最高放氧速率為3 μmol O2·h－1·g－1（DW），反應 1 h，放氧速率為3 μmol O2·h－1·g－1（DW），反應 3 h 后，反應器內無液態(tài)水時，檢測不到放氧。隨著反應時間的延長放氧能力有所恢復，但是29 h后發(fā)菜又失去放氧能力。從以上數(shù)據推測，如果繼續(xù)將溫度降低到0℃時，發(fā)菜將不會有放氧，因此，本試驗沒有設計做0℃以下的試驗。

將5℃、15℃和25℃不同氣壓條件下發(fā)菜光合放氧最大放氧速率和平均放氧速率總結至表2中。從表2數(shù)據中可以看出，當發(fā)菜在氣壓低于相應溫度蒸氣壓下即沒有液態(tài)水的情況下，放氧能力下降，必需有少量液態(tài)水，且隨著溫度下降，放氧速率也會下降。本試驗中，發(fā)菜復蘇標準定義為發(fā)菜光合放氧速率達到發(fā)菜在正常狀態(tài)的 1% ，即 4 μmol O2·h－1·g－1（DW）。 因此，本試驗中發(fā)菜復蘇的極限條件是5℃、1.4 kPa。

圖5 5℃不同狀態(tài)水對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.5 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

表2 不同溫度和氣壓下水分狀態(tài)對發(fā)菜光合放氧影響Table 2 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at dif?ferent temperatures

3.2 不同含水量對發(fā)菜光合放氧影響

李運廣等報道發(fā)菜生長于干旱、半干旱地區(qū)，水分是其生長的主要限制因子［15］。為了確定在模擬火星條件下含水量對發(fā)菜光合放氧能力的影響關系，我們在最低溫度5℃條件下加入不同體積的BG11液體培養(yǎng)基（圖6）。在5℃、氣壓為1.7 ～1.9 kPa（水的狀態(tài)為液態(tài)水），加入 5 mL?BG11液體培養(yǎng)基，可以看到放氧速率最高值上升至7 μmol O2·h－1·g－1（DW）（圖 6A）；而當加入10 mL BG11液態(tài)培養(yǎng)基時，發(fā)菜的最大放氧速率上調至 12 μmol O2·h－1·g－1（DW），甚至超過了25℃液態(tài)水條件下最高速率 10 μmol O2·h－1·g－1（DW）（圖6B、表2）；此外，發(fā)菜復蘇過程中加入水分，整個復蘇過程（31 h），發(fā)菜保持著放氧能力。這個結果說明在類火星環(huán)境下水對發(fā)菜復蘇的影響很大。

圖6 5℃不同含水量對發(fā)菜光合放氧的影響Fig.6 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

3.3 類火星環(huán)境下氣壓、水、溫度對發(fā)菜光合放氧復蘇影響力比較

發(fā)菜在野外生長地年最高氣溫可達39.1℃，最低低溫可達－28.0℃，變幅為67.1℃。在這種氣溫幅度中，地表最高氣溫可達65.7℃，地表最低溫度達－29.1℃，實際上發(fā)菜所能忍受的溫度差值達到94.8℃［9］。 因此溫度不是發(fā)菜生長的限制因素。此外，本試驗室前期結果顯示在－20℃下，100 Pa、600 Pa、1200 Pa處理60 天后，發(fā)菜能夠在BG11培養(yǎng)基中恢復放氧［11］，這些結果已經說明低溫和低氣壓不是限制發(fā)菜復蘇的因素。地球上的生物進化到可以耐受高氣壓環(huán)境如深海環(huán)境，但是由于地球環(huán)境因素沒有類似于火星環(huán)境中的低氣壓，目前幾乎沒有關于生物對于低氣壓環(huán)境適應機制的研究［18］。

綜合5℃條件下水的不同狀態(tài)及含有液態(tài)水下發(fā)菜的放氧速率（表3），可以看到液態(tài)水是影響發(fā)菜復蘇的重要決定性因素，溫度和氣壓不是最大限制性因素。

表3 5℃下不同含水量對發(fā)菜光合放氧影響Table 3 The photosynthetic oxygen evolution rate of N.flagelliforme treated by different water at 5℃

4 結論

1）通過選用高真空玻璃閥門組件，使發(fā)菜在長時間存放后仍保持氣壓及氣體組成為所需狀態(tài)，成功搭建了在線監(jiān)測發(fā)菜復蘇放氧裝置。

2）檢測顯示5℃、15℃和25℃在高于和低于相應水飽和蒸氣壓條件下，發(fā)菜光合放氧最大放氧速率分別為5、7 和10 μmol O2·h－1·g－1（DW），和1、2 和3 μmol O2·h－1·g－1（DW），驗證了試驗最初的設想，發(fā)菜在類火星條件下可以復蘇；而在5℃，低于水飽和蒸氣壓時，加入10 mL BG11時，發(fā)菜放氧速率最高上調至 12 μmol O2·h－1·g－1（DW），這說明水對發(fā)菜在類火星表面半開放體系復蘇的影響大于氣壓。

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