王佳斌 朱鳳曉 高娟 施維林*

1 背景及意義

PAEs是一類重要的環(huán)境內分泌干擾物[1]，主要被用作塑料產品增塑劑[2]。PAEs與塑料分子主要依靠氫鍵和范德華力結合而不是共價鍵連接[3],因此PAEs極易在生產、使用和焚化掩埋等過程中釋放到水、空氣和土壤環(huán)境中。我國工農業(yè)區(qū)土壤均已遭受PAEs不同程度污染[4]，含量一般在μg/kg至mg/kg數量級[5]。鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯 (DEHP)，是一種重要的PAEs類化合物，也是目前世界上應用廣泛和生產量大的人工合成的有機污染物之一[6]。其化學結構式如圖1所示。

圖1 DEHP的化學結構

DEHP具有較好的脂溶性，對生物體和固體顆粒表現出很強的親和性和吸附性[7]。DEHP和鄰苯二甲酸丁酯(DBP)，在大氣、水體、土壤和底泥中的檢出率和含量都較高[8]。例如廣州和深圳蔬菜生產基地土壤中的Σ6PAEs 為 3.0-45.7 mg/kg，DBP 和DEHP為主要組分，含量分別為ND-20.6 mg/kg和2.85-25.1 mg/kg[9]。DEHP 對生物體的慢性毒性效應備受關注。雖然沒有明顯的急性毒性作用，但在大劑量情況下，對動物具有致癌、致畸、致突變作用，顯示出較強的內分泌干擾性[10]。DEHP的主要代謝產物為MEHP，同DEHP一樣，對動物細胞有致突變作用[11]，可對幼鼠生精功能造成損害[12]。因此，有必要加強DEHP（和MEHP）在環(huán)境中的降解機理方面的研究，研發(fā)有效的去除方法，以減少對生物健康造成的危害。

圖2 土壤中不同濃度DEHP和MEHP的降解注：標有相同小寫英文字母的處理之間沒有顯著性差異（p＞0.05）

在環(huán)境中，PAEs的水解、光解和揮發(fā)速率非常緩慢，生物降解是其在環(huán)境中分解的主要途徑[13]。環(huán)境中PAEs的降解與分布在很大程度上取決于微生物的群落結構與功能差異，理解微生物介導的PAEs代謝機制可為PAEs環(huán)境歸趨研究與PAEs修復提供理論基礎。但目前對PAEs(尤其是DEHP)降解菌群落結構與功能的認識還非常有限[14]，對PAEs降解的微生物群落效應研究還未展開。因此，本文將考察不同土壤PAEs含量下，DEHP和MEHP的微生物群落效應，以期揭示兩種重要污染物在不同狀態(tài)下的微生物代謝機理。

2 材料與方法

2.1 風干土活化

取風干保存的南京市江寧區(qū)蔬菜地土樣，添加無菌水至含水率約為60%的最大持水率，在25℃條件下培養(yǎng)10天，以穩(wěn)定和活化土壤微生物。每種處理需要土壤(7*3)*20=420 g(干重)。需土壤：420*5=2100 g(干重)。無菌對照，每種處理需要4*3*8=96 g(干重)；共 4 種處理，需土壤 384 g（干重）。

2.2 污染物溶液配制

10 mg/mL DEHP溶液：稱700 mg DEHP于100mL藍蓋玻璃瓶中，準確加入70 mL丙酮，蓋緊蓋子，搖動瓶子后，超聲助溶。

10 mg/m L MEHP溶液：稱700 mg MEHP于100m L藍蓋玻璃瓶中，準確加入70 mL丙酮，蓋緊蓋子，搖動瓶子后，超聲助溶。

2.3 土壤制備

CK:稱取干重為 50 g（濕重 59.17 g）的土壤于240 mL玻璃瓶中，添加42 mL丙酮。待丙酮揮發(fā)完，倒入盛有干重為370 g（濕重437.87 g）土壤的陶瓷攪拌盆，拌勻。

DEHP100:稱取干重為50 g的土壤，添加4.2 mL DEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）和37.8 mL丙酮。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370 g的土壤拌勻。

DEHP1000:稱取干重為50 g的土壤，添加42 mL DEHP溶液（dissolved in acetone,10mg/mL）。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370g的土壤拌勻。

MEHP100:稱取干重為50 g的土壤，添加4.2 mL MEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）和37.8 mL丙酮。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370 g的土壤拌勻。

MEHP1000:稱取干重為50 g的土壤，添加42 mL MEHP溶液（dissolved in acetone,10 mg/mL）。待丙酮揮發(fā)完，與干重為370 g的土壤拌勻。

分裝100 mL錐形瓶中培養(yǎng)，每瓶含土20g（干重）。補充水分至60%最大持水量。

3 結果與討論

3.1 DE HP和M E HP的降解

圖3 不同濃度DEHP和MEHP對土壤細菌數量的影響

圖4 培養(yǎng)42天時，不同濃度DEHP對土壤中細菌群落的影響（門和屬水平）注：α-Pro、β-Pro、δ-Pro、γ-Pro和 unclassified-Pro分別表示 α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、γ-Proteobacteria和unclassified Proteobacteria；藍色字體代表DEHP抑制菌群；*和**分別表示顯著性水平p＜0.05和p＜0.01。

土壤中DEHP100在21天及42天的平均降解率分別為42.1%及51.2%，DEHP1000在21天及42天的平均降解率分別為36.9%及46.0%（圖2），總體上在兩個濃度下，隨著時間的增加，降解率有一定程度的增加，但是DEHP100與DEHP1000降解率之間沒有顯著性差異。

本實驗另設置了MEHP處理組，設置MEHP處理組是因為MEHP是DEHP的重要代謝產物（通常經微生物作用，DEHP首先被降解成MEHP），設置MEHP組可便于考察DEHP中間代謝產物的代謝菌群。圖2表示，土壤中MEHP100在21天及42天的平均降解率分別為99.7%及99.9%，DEHP1000在21天及42天的平均降解率分別為97.1%及98.1%，隨著時間的增加，降解率一定程度上有所增加，在21天及42天之間沒有顯著性的差異，但是較高濃度的MEHP1000的降解速率顯著低于低濃度的MEHP組的降解速率。實驗中沒有發(fā)現MEHP或其他產物累積，表明在該土壤中DEHP的降解較為徹底。由于MEHP是DEHP的一種代謝產物，其分子量較小，因此MEHP在土壤中被微生物代謝的速率顯著高于DEHP。Cartw right[15]及Otton[16]等學者也發(fā)現了類似的現象。

3.2 DE HP和M E HP對土壤細菌數量的影響（圖3）

另外分析了土壤中的細菌數量，在21天后，空白對照組細菌數量為65.1（*105CFUs/g soil），DEHP100組為72.3（*105CFUs/g soil），DEHP1000為75.6（*105CFUs/gsoil）。DEHP的加入在一定程度上增加了這些異養(yǎng)菌的數量，但是效果不顯著。另外MEHP100組為65.5（*105CFUs/g soil），MEHP1000組為60.2（*105CFUs/g soil），與空白對照組沒有顯著性差異，沒有顯著增加異養(yǎng)菌數量，反而高濃度的MEHP處理組中細菌數量有所減少。42天后，在空白對照組中生物量為68.7（*105CFUs/gsoil），DEHP100為69.5（*105CFUs/g soil），DEHP 1000為70.3（*105CFUs/g soil）。DEHP的加入在同樣一定程度上增加了這些異養(yǎng)菌群的數量，但是效果不顯著。MEHP100為70.7（*105CFUs/g soil），MEHP1000為68.3（*105CFUs/g soil），與空白對照組沒有顯著性差異。Cartwright等人的研究也同樣發(fā)現DEHP1000ppm對土壤細菌總數沒有影響[15]。

3.3 DE HP對土壤細菌群落的影響

為了進一步了解DEHP對微生物菌群的影響，本研究使用高通量測序的手段分析了不同處理土壤中的細菌群落結構和組成（圖4）。在實驗土壤中，主要菌群為變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），而其他常見菌群如酸桿菌門（Acidobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和芽單胞菌門（Gemmati-monadetes）所占比例相對較低。在門水平上，DEHP處理對細菌菌群的影響不大，僅有兩個門被顯著影響：DEHP100處理顯著提高了α-變形菌綱（α-Proteobacteria） 的 豐 度 ， 以 及DEHP1000顯著降低了芽單胞菌門的豐度。

在屬的水平上，我們發(fā)現DEHP污染對多個細菌菌群有顯著影響。主要表現為：DEHP100顯著提高了變形菌門下α-和β-變形菌綱中的一些屬；DEHP1000則顯著提高了放線菌門下放線菌目中的一些屬。此外，兩者同時抑制了芽單胞菌門下的芽單胞菌屬(Gemmatimonas)。可能的原因是已有報道的降解作用及碳代謝作用。

4 結論

不同濃度DEHP在土壤中降解均較慢，培養(yǎng)42天后降解約50%；其單酯降解產物MEHP在該土壤中可迅速降解，故DEHP降解過程中未檢測到MEHP產物殘留。培養(yǎng)42天后，DEHP污染對土壤細菌總數和細菌群落結構沒有顯著影響，表明其急性毒性較低。但兩種濃度下均顯著改變了一些菌群的相對豐度，可能會引起土壤微生物功能的改變。

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