曹銘晨，方孟香，黃 欣

鬼針草，又名婆婆針，為菊科一年生植物鬼針草（Bidensbipinnat a L.）的干燥全草，中國(guó)大部分地區(qū)均有分布。鬼針草始載于唐代《本草拾遺》，有解熱、止瀉、解毒和活血散瘀等功效，曾被收錄于1977年版《中國(guó)藥典》。從鬼針草中分離得到活性化合物成分有黃酮類(lèi)、聚炔類(lèi)、有機(jī)酸及其酯和揮發(fā)油等，在抗高血壓、抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗炎、保肝護(hù)肝、抗結(jié)石等方面均表現(xiàn)出藥理活性[1-2]。據(jù)報(bào)道，鬼針草的水提液可抑制堪薩斯分枝桿菌生長(zhǎng)[3]，醇提物則對(duì)金黃色葡萄球菌、黑根霉菌、鏈格孢菌及灰葡萄孢菌存在不同程度的抑制作用[4]，表明鬼針草中存在抑菌活性成分。陳飛虎團(tuán)隊(duì)篩選發(fā)現(xiàn)鬼針草總黃酮為其有效部位[5]，目前關(guān)于鬼針草有效部位抗菌活性的研究較少，本研究評(píng)價(jià)小花鬼針草總黃酮部位的抗菌活性，為鬼針草黃酮類(lèi)成分的研究與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津UV-3010型紫外分光光度計(jì)，52CS-2旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），METTLERAE 240型電子分析天平（瑞士梅特勒公司），DK-8244電熱恒溫水浴鍋（江蘇常州國(guó)華電器有限公司），BSP-250生化培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 干燥小花鬼針草藥材經(jīng)山東中醫(yī)制藥系周長(zhǎng)征老師鑒定為小花鬼針草（Bidens parviflora willd.）。

1.3 實(shí)驗(yàn)菌種 黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌由某醫(yī)院提供，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.4 試劑與試藥 95%乙醇、乙醇購(gòu)自山東省禹王化工分公司，石油醚、乙酸乙酯、M-H培養(yǎng)基、瓊脂購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。蒸餾水為自制，水為杭州娃哈哈純凈水，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物藥品檢定所。

2 方法與結(jié)果

2.1 小花鬼針草總黃酮制備 參照文獻(xiàn)[4-6]標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.1 提取 取干燥小花鬼針草適量，粉碎后稱取20 g置圓底燒瓶中，加入50%乙醇200 mL加熱回流1 h后濾過(guò)，再加入50%乙醇200 mL加熱回流1 h，合并濾液；以石油醚萃取至石油醚層無(wú)色，棄去石油醚層；再加乙酸乙酯萃取，將乙酸乙酯部位65℃減壓濃縮至10 mL。

2.1.2 精制 以大孔樹(shù)脂AB-8柱層析分離，蒸餾水洗脫至無(wú)色，70%乙醇洗脫300 mL，收集有黃酮顏色反應(yīng)的洗脫液，濃縮后真空干燥即得。

2.1.3 含量測(cè)定 依據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》山楂葉中總黃酮含量的測(cè)定方法，以蘆丁為對(duì)照品，用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定小花鬼針草總黃酮的含量。

2.1.3.1 線性關(guān)系考察 測(cè)定不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=3.035 9X+0.007 4（r2=0.999 9）。結(jié)果表明，蘆丁檢測(cè)濃度在0.0261 6～0.130 80 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.3.2 樣品含量測(cè)定 精密稱定總黃酮樣品10 mg，平行5次測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，樣品中平均黃酮含量為74.76%。

表1 鬼針草總黃酮部位中的黃酮含量測(cè)定結(jié)果（以蘆丁計(jì)）

2.2 小花鬼針草總黃酮抑菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 K－B紙片藥敏實(shí)驗(yàn)

2.2.1.1 菌液配制 將4種菌分別接種于瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取形態(tài)相似菌落5～6個(gè)，接種于10 mL的 M－H培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3 h；用生理鹽水配制成0.5麥?zhǔn)?比濁標(biāo)準(zhǔn)，即含1×108CFU/mL的菌懸液。

2.2.1.2 紙片制備 精密稱取總黃酮樣品10 mg至100mL容量瓶，以75%乙醇溶解并以蒸餾水定容，搖勻，取該溶液適量分別以蒸餾水稀釋成濃度為10、30、50、70、100μg/mL的總黃酮溶液；將空白藥敏紙片（6 m m）分別置于西林瓶（蒸餾水清洗后高熱滅菌，備用）中（1片/瓶），分別加入不同濃度溶液1 mL，均勻吸收后置于37℃恒溫箱內(nèi)干燥。

2.2.1.3 平板接種 分別取上述菌株的新鮮培養(yǎng)物，用涂布棒蘸取適量菌液均勻涂布于整個(gè)培養(yǎng)基表面。將含有藥樣的藥敏紙片濾水，微干后鋪于平板表面，置37℃恒溫箱孵育18～24 h。

2.2.1.4 抑菌環(huán)直徑測(cè)量 培養(yǎng)結(jié)束取出平板，測(cè)定抑菌環(huán)直徑并記錄。每個(gè)樣品平行3次測(cè)定，取抑菌環(huán)直徑平均值，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 小花鬼針草總黃酮的最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定 采用倍比稀釋法，取試管編號(hào)1～8，1號(hào)管裝1.8 mL液體培養(yǎng)基，2～8號(hào)管裝液體培養(yǎng)基1 mL。高壓滅菌后冷卻，無(wú)菌操作下，在1號(hào)管加入濃度為1 mg/mL的鬼針草總黃酮溶液0.2 mL，搖勻后，從1號(hào)試管吸取1 mL混合液移入2號(hào)管，依次操作后，1～7號(hào)管中，鬼針草提取物濃度依次為100、50、25、2.5、6.25、3.125、1.56 μg/mL。到 8 號(hào)管棄去1 mL，8號(hào)管作對(duì)照管。1～8號(hào)試管各加入菌懸液0.1 mL，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，肉眼觀察對(duì)照試管混濁（+，有細(xì)菌顯著生長(zhǎng)），判定澄清（－，無(wú)肉眼可見(jiàn)菌生長(zhǎng)）試驗(yàn)管的最低濃度為鬼針草對(duì)該菌的MIC，結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 不同劑量小花鬼針草總黃酮對(duì)4種細(xì)菌抑菌環(huán)直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果 μg/片

表3 小花鬼針草總黃酮的最低抑菌濃度

3 小結(jié)與討論

植物源抗菌物質(zhì)在自然界中廣泛存在，植物體內(nèi)的許多次生代謝產(chǎn)物如生物堿、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和酚類(lèi)化合物等存在殺菌活性[7－8]，研究表明植物源黃酮類(lèi)物質(zhì)具有廣譜抑菌性[9－10]。本實(shí)驗(yàn)研究了小花鬼針草乙酸乙酯部位總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌等4種菌的抗菌作用，結(jié)果顯示對(duì)大腸桿菌幾乎無(wú)抑菌作用，對(duì)白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌有較好的抑菌作用。與文獻(xiàn)報(bào)道鬼針草醇提取物在體外對(duì)金黃色葡萄球菌和真菌有抑制作用[11－13]一致，提示總黃酮為鬼針草抗菌的有效部位?？傸S酮部位對(duì)多種菌表現(xiàn)出抑制作用，可能有較廣的抗菌譜。

目前已從鬼針草總黃酮中分離出許多單體成分，如 2（R/S）－異奧卡寧－（3′，4′－二甲醚）－7－O－β－D－葡萄糖苷、（Z）－6－O－（6′－O－乙?；拢璂－吡喃葡萄糖基）－6，7，3′，4′－四羥基橙酮、海生菊苷、異槲皮苷等，并研究各單體成分的抗肝纖維化、抗氧化等藥理作用[9－11]，但幾乎沒(méi)有對(duì)單體成分的抗菌研究，下一步將篩選乙酸乙酯部位黃酮中的抗菌單體成分，深入探討其單體活性成分的抑菌機(jī)制及其構(gòu)效關(guān)系。本研究為小花鬼針草黃酮部位抗菌作用的深入研究，及作為新型天然植物源防腐劑的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)，促進(jìn)鬼針草資源更合理的利用。

[1] Bo Y,Yuan LP,Zhang JJ,et al.Total flavonoids of Bidensbipinnata L．a(chǎn) traditional Chinese medicine inhibits the production of inflammatory cytokines of vessel endothelial cells stimulated by sera from Henoch-Schonlein purpura patients[J].J Pharm Pharmacol，2012,64(6):882－887.

[2] 吳婷妮,余長(zhǎng)柱,李 榮,等.鬼針草的研究進(jìn)展[J].安徽醫(yī)藥,2014,18(9):1614-1616.

[3] 李國(guó)利,莊玉輝,那學(xué)明,等.3種中藥對(duì)分枝桿菌抗菌作用的研究[J].微生物學(xué)通報(bào),1989,16(3):153-157.

[4] 陳建中,葛水蓮,肖玉菲.菊科植物鬼針草浸提物抑菌活性研究[J].北方園藝,2012,36(21):83-85.

[5] 許 慧,陳飛虎,邵 旭,等.鬼針草總黃酮提取工藝中試研究[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(6):738-740.

[6] 曲永勝.鬼針草黃酮化合物的提取及工藝優(yōu)化[J].山東醫(yī)藥,2010,54(35):62.

[7] 周利娟,黃繼光,徐漢虹,等.菊科植物的殺菌活性及其活性成分[J].西北植物學(xué)報(bào),2006,27(9):1959-1964.

[8] 嚴(yán)梅楨,左 風(fēng),宋紅月,等.黃芩湯及其代謝產(chǎn)物抗菌作用的比較研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥雜志,2003,28(3):243-246.

[9] 欒曉蕓,白 洋,陳 穎,等.心腦舒通中黃酮類(lèi)成份研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,34(5):291-295.

[10]李 葉,唐浩國(guó),劉建學(xué).黃酮類(lèi)化合物抑菌作用的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2008,4(12):53-55,69.

[11]蔣海強(qiáng),王建平,范 輝.鬼針草黃酮抗氧化研究[J].山東中醫(yī)雜志,2010,30(3):196-197.

[12]黎 平,王業(yè)玲,唐 麗,等.三葉鬼針草的黃酮苷類(lèi)成分研究[J].中草藥,2013,44(18):2498-2501.

[13]鄧子云.鬼針草總黃酮部分化學(xué)成分研究及其抗肝纖維化活性初步篩選[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué),2015.