張惠敏，任瑩璐，柳金英，謝 璇，王 青，蘇聰平，王 偉，郭淑貞

心力衰竭（心衰）是各類(lèi)心血管疾病的嚴(yán)重或終末階段，5年生存率與惡性腫瘤相當(dāng)。目前中國(guó)心衰的患病率為0.9%，推算的患病人數(shù)高達(dá)450萬(wàn)[1-2]。近年來(lái)，西藥治療心衰雖取得了一定效果，但毒副作用較大，治療成本快速增加，臨床應(yīng)用受到極大限制。

心衰屬中醫(yī)胸痹、心悸、怔忡等范疇。近年來(lái)，有不少學(xué)者在治療心衰的復(fù)方中配伍清熱解毒藥物，取得了較好的療效[3-4]，清熱解毒類(lèi)中藥成為心衰治療藥物或成分篩選的重要新來(lái)源。

穿心蓮具有清熱解毒，涼血消腫等功效，穿心蓮內(nèi)酯是爵床科植物穿心蓮中提取得到的二萜內(nèi)酯類(lèi)化合物，是中藥穿心蓮的主要有效成分之一[5]。已有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯具有抗心肌缺血和抗缺血-再灌注損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)脂、降血壓、抗血小板聚集、抗動(dòng)脈粥樣硬化和改善血液流變性等心血管保護(hù)作用[6-7]，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。本實(shí)驗(yàn)擬觀(guān)察穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)過(guò)量異丙腎上腺素（ISO）致小鼠心衰的藥效，并進(jìn)一步采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)，為穿心蓮內(nèi)酯治療心衰作用機(jī)制和靶點(diǎn)的闡明提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)健康C57BL雄性小鼠24只，體質(zhì)量（20±1）g。均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，恒溫恒濕環(huán)境，自由飲水，普通飼料。

1.2 藥物與試劑 穿心蓮內(nèi)酯（批號(hào)：16051709）由成都普思生物科技有限公司提供。地高辛（批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H31020678）由上海信誼藥廠(chǎng)有限公司提供。鹽酸異丙腎上腺素（ISO，批號(hào)：101722747）由西格瑪-奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司提供等。

1.3 儀器與材料 加拿大VisualSonics公司高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)Vevo2100以及配置的超聲探頭（MS-400型號(hào)）；ABI StrpOnePlus Real-Time PCRSystem（美國(guó)ABI公司）等。

1.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù) 在線(xiàn)中醫(yī)藥生物信息學(xué)分析工具（B ATMAN－TCM）[8]。

2 方法

2.1 分組與造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、穿心蓮內(nèi)酯組、地高辛組等4組。心衰模型的造模方法采用團(tuán)隊(duì)前期建立的鹽酸異丙腎上腺素梯度造模法：按照第1天20 mg/kg，第 2 天 10 mg/kg，第 3～14 天 5 mg/kg的梯度劑量，給予小鼠皮下注射ISO[9]。給藥組和模型組按上述方案造模?？瞻捉M皮下注射生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。從造模即日起，各給藥組灌胃給藥，穿心蓮內(nèi)酯組給予穿心蓮內(nèi)酯200 mg/（kg·d），地高辛組每天給予地高辛0.165 mg/（kg·d），模型組與空白組動(dòng)物給予同體積純凈水，連續(xù)給藥14 d，每天1次。

2.2 小鼠心臟超聲檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，采用Visual Sonics Vevo 2100小動(dòng)物高分辨率顯微超聲成像系統(tǒng)評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)組小鼠的心臟結(jié)構(gòu)及心功能，測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd），分別計(jì)算射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）和舒張?jiān)缙诙獍暄魉俣扰c舒張晚期二尖瓣血流速度比值（E/A）。每只動(dòng)物采樣3次，記錄3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

2.3 心臟指數(shù)計(jì)算 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，測(cè)量小鼠體質(zhì)量。小鼠腹腔麻醉后腹主動(dòng)脈取血，處死后，迅速開(kāi)胸，摘取心臟，用磷酸緩沖液（PBS）沖洗心腔中的血塊，剪除心臟周?chē)Y(jié)締組織和血管，稱(chēng)取心臟質(zhì)量，后續(xù)用于計(jì)算心臟指數(shù)。心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）。

2.4 病理學(xué)檢測(cè) 心臟組織放入4%多聚甲醛固定，常規(guī)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀(guān)察并記錄病變情況。

2.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 在BATMAN－TCM在線(xiàn)網(wǎng)站中輸入穿心蓮內(nèi)酯，得到藥物治療疾病與靶點(diǎn)交互數(shù)據(jù)集（P＜0.05；score=10）。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法（RT－qPCR）檢測(cè)靶點(diǎn)基因mRNA表達(dá) 取實(shí)驗(yàn)小鼠心肌組織(約200 mg)，用Trizol試劑提取總RNA，使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA。β－actin:上游引物5’－GGCTGTATTCCCCTCCATCG－3’，下游引物 5’－CCAGTTGGTAACAATGCCATGT－3’；HMGCR 上游引物 5’－TGTTCACCGGCAACAACAAGA－3’，下游引物 5’－CCGCGTTATCGTCAGGATGA－3’。RT－PCR反應(yīng)體系每個(gè)樣本20μL，加入到96孔板中，每個(gè)樣本重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，放入PCR儀進(jìn)行熒光定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)平均相對(duì)含量（2－ΔΔCT）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 心臟超聲 與空白組相比，實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)模型組LVIDs、LVIDd 顯著增加，EF、FS 和 E/A 顯著降低（P＜0．05）。與模型組相比，穿心蓮內(nèi)酯組可以顯著降低心衰小鼠心室的 LVID s（P＜0．01），有降低 LVIDd的趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可顯著增高EF、FS和E/A（P＜0．01），結(jié)果與陽(yáng)性藥地高辛作用相似。綜上所述，穿心蓮內(nèi)酯對(duì)過(guò)量異丙腎誘導(dǎo)的心衰具有顯著改善作用，見(jiàn)表1。

表1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)過(guò)量異丙腎上腺素致心衰小鼠心功能的影響（x±s）

3.2 心臟指數(shù) 與空白組比，模型組心臟指數(shù)顯著增加（P<0.01）；與模型組比，穿心蓮內(nèi)酯組可有效降低心衰小鼠心臟指數(shù)（P＜0.01），與陽(yáng)性藥地高辛作用相近。見(jiàn)表2及圖1。

3.3 病理學(xué)檢測(cè) 從HE染色結(jié)果看，模型組動(dòng)物心肌組織中，心肌細(xì)胞體積增大、肥厚，伴有血竇擴(kuò)張和結(jié)締組織增生。與模型組相比，穿心蓮內(nèi)酯組動(dòng)物心肌細(xì)胞的肥大程度顯著減輕，與陽(yáng)性藥地高辛有相似改善作用，見(jiàn)圖2。

表2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)過(guò)量ISO致心衰小鼠心質(zhì)量指數(shù)的影響（x±s）

圖1 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)過(guò)量ISO致心衰小鼠形態(tài)學(xué)的影響

圖2 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)過(guò)量異丙腎上腺素致心衰小鼠心肌組織形態(tài)的影響（HE 染色，×40）

3.4 穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)心力衰竭的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合文獻(xiàn)分析，提示穿心蓮內(nèi)酯與心衰的相關(guān)靶點(diǎn)可能為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR，HMG-CoA還原酶）基因。

3.5 心肌組織HMG-CoA還原酶基因mRNA表達(dá)水平 各組小鼠心肌組織HMG-CoA還原酶基因mRNA表達(dá)水平如表3所示。與空白組比較，模型組HMG-CoA還原酶基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；穿心蓮內(nèi)酯組可以顯著降低過(guò)量異丙腎上腺素模型動(dòng)物心肌組織中HMG-CoA還原酶基因表達(dá)（P＜0.05），與BATMAN預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

表3 穿心蓮內(nèi)酯對(duì)過(guò)量ISO致心衰小鼠HMG-CoA還原酶表達(dá)的影響（x±s）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察穿心蓮內(nèi)酯干預(yù)過(guò)量ISO致小鼠心衰的心功能、病理學(xué)、形態(tài)學(xué)和HMG-CoA還原酶基因變化水平，為穿心蓮內(nèi)酯治療心衰作用機(jī)制和靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。通過(guò)超聲檢測(cè)、病理學(xué)和形態(tài)學(xué)結(jié)果分析，穿心蓮內(nèi)酯可以改善ISO致心衰小鼠的心臟舒張功能與收縮功能，并減輕模型小鼠心肌細(xì)胞肥大程度。本研究檢索BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)得出穿心蓮內(nèi)酯與心血管病相關(guān)的靶點(diǎn)HMG-CoA還原酶，并進(jìn)一步通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法驗(yàn)證該基因的mRNA在模型小鼠中的表達(dá)結(jié)果顯示，與模型組相比，穿心蓮內(nèi)酯組小鼠心肌組織HMG-CoA還原酶基因表達(dá)明顯下調(diào)，提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過(guò)抑制HMG-CoA還原酶、調(diào)節(jié)膽固醇合成進(jìn)而改善ISO引起的心衰過(guò)程。

HMG-CoA還原酶是膽固醇合成的重要中間產(chǎn)物和關(guān)鍵限速酶，其表達(dá)和活性均受到生物體體內(nèi)膽固醇含量的反饋調(diào)節(jié)[10]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇代謝標(biāo)志物很可能是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]，與冠狀動(dòng)脈病變程度密切相關(guān)。膽固醇能通過(guò)影響巨噬細(xì)胞的泡沫化和凋亡，從而破壞動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定并形成壞死灶[12-14]。臨床研究表明，血漿中膽固醇吸收標(biāo)志物菜油固醇水平越高，全因死亡率和心血管死亡率越高[15]。

目前常用的他汀類(lèi)藥物（如辛伐他汀、阿托伐他汀等）主要用于心血管疾病的預(yù)防與臨床治療，其治療機(jī)制主要是通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMG-CoA還原酶合成而達(dá)到抑制膽固醇合成，同時(shí)此類(lèi)藥物對(duì)患者并無(wú)致死或者致癌因素。隨著藥物研究的不斷發(fā)展，逐步發(fā)現(xiàn)他汀類(lèi)藥物治在改善心功能的同時(shí)伴隨著一些不良反應(yīng),如肌肉毒性、肝酶異常、糖尿病高發(fā)等嚴(yán)重影響著藥物臨床效用的發(fā)揮[16-17]。因此，針對(duì)心血管相關(guān)HMG-CoA還原酶抑制劑研發(fā)，仍然是膽固醇合成靶向治療心血管疾病取得突破性進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與經(jīng)典藥理學(xué)方法相結(jié)合的研究途徑，研究穿心蓮內(nèi)酯的藥效靶點(diǎn)，并進(jìn)一步驗(yàn)證，初步探討穿心蓮內(nèi)酯治療心衰的機(jī)制可能與抑制HMG-CoA還原酶有關(guān)，從而為穿心蓮內(nèi)酯治療心血管疾病提供了新的證據(jù)，但確切的機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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