劉 穎 ，張 軍 ，趙 靜，王海英 ，王軍媛 ，王明星，劉曉曼 ，王順意 ，戴金穎，袁 潔

糖尿病的發(fā)生、發(fā)展不僅取決于遺傳因素，而且也受到表觀遺傳修飾的調(diào)控，有研究表明miRNAs與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]，但兩者之間的互相影響的機(jī)制比較復(fù)雜，目前仍無(wú)定論，但通過(guò)改變或者修飾相關(guān)miRNAs的表達(dá)，可作為糖尿病診療的新靶點(diǎn)，已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。胰島素抵抗（IR）是2型糖尿病主要發(fā)病機(jī)制之一，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰活血中藥可以改善糖尿病大鼠胰島素抵抗[2]，本研究通過(guò)測(cè)定miRNA－126在肝臟組織的表達(dá)，探討益氣養(yǎng)陰活血方改善胰島素抵抗的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，雄性，12周，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由飲食、攝水，溫度21～25℃，濕度50%～60%，明暗周期（12 h/12 h）。動(dòng)物購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所，許可證號(hào)SCXK－（軍）－2014－0001。

1.2 藥物 自擬益氣養(yǎng)陰活血方：黃芪12 g，太子參 12 g，熟地黃 15 g，黃精 9 g，牡丹皮 9 g，丹參15 g，三七粉 3 g，鬼箭羽 15 g，山茱萸 9 g，葛根 15 g，麥冬9 g，為中藥免煎顆粒，購(gòu)自中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，津力達(dá)顆粒（以嶺藥業(yè)），購(gòu)自唐山市中醫(yī)醫(yī)院。

1.3 主要儀器 血糖儀（拜耳公司）、Cobas－8000型全自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)羅氏）。Infinite?200 PRO型多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯公司）；Ep realplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Eppendorf公司）；

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備 隨機(jī)抽取10只作為空白組，予普通飼料，其余50只為實(shí)驗(yàn)組，予高脂飲食，小劑量多次腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)形成糖尿病模型，成模后隨機(jī)分為模型組、津力達(dá)組、益氣養(yǎng)陰活血方低、中、高劑量治療組5組（以下簡(jiǎn)稱低、中、高劑量組）。

2.2 干預(yù)方法 除空白組及模型組，其余4組分別給予相應(yīng)藥物灌胃，津力達(dá)組以津力達(dá)顆粒3.0 g/kg灌胃，益氣養(yǎng)陰活血方按成人劑量換算低、中、高劑量組分別為 13.75、27.50、55.00 g/kg，每日上午灌服1次，空白組和模型組給予等量生理鹽水，干預(yù)4周。

2.3 取材及指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 生化指標(biāo) 觀察各組大鼠的空腹血糖（FBG）及餐后2 h血糖（2 hBG），空腹胰島素水平（FINS），糖化血清蛋白（GSP）。

2.3.2 肝臟細(xì)胞病理變化 處死大鼠后取肝臟組織，蘇木精－伊紅（HE）染色，光鏡下觀察各組大鼠肝臟組織的病理變化。

2.3.3 qRT－PCR測(cè)定mi－RNA含量 提取肝臟組織總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，準(zhǔn)備引物：miRNA－126、U6 PCR引物及莖環(huán)引物，離心機(jī)離心，開蓋，DEPC水溶解稀釋，置于－20℃冰箱中備用。qRT－PCR擴(kuò)增反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA，反應(yīng)條件：95℃、10min，95 ℃、15 s，61 ℃、30 s，40 cycles，反應(yīng)結(jié)束后做擴(kuò)增曲線、熔解曲線分析。PCR擴(kuò)增完成后，調(diào)整基線及閾值。目的基因計(jì)算公式：目的基因相對(duì)量=2－ΔΔCt，ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法 所有的數(shù)據(jù)使用SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠FBG、2 hBG、GSP、FINS和體質(zhì)量比較 與空白組相比，模型組和各治療組FBG、2 hPG、GSP明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組FBG、2 hPG、GSP 明顯降低（P＜0.05）；與津力達(dá)組相比，中劑量組2 hPG降低（P＜0.05）。與空白組相比，模型組和各治療組FINS明顯升高（P＜0.05），模型組體質(zhì)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，各治療組FINS、體質(zhì)量明顯降低（P＜0.05）；與津力達(dá)組相比，中劑量組 FINS降低（P＜0.05）。見表 1～2。

3.2 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織的影響 HE染色結(jié)果顯示：空白組肝臟具有正常的結(jié)構(gòu)，肝小葉清晰可見，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心呈放射狀排列，排列整齊，肝細(xì)胞胞質(zhì)均勻豐富，無(wú)水腫及脂肪變性，無(wú)明顯病變。模型組肝臟結(jié)構(gòu)破壞明顯，肝小葉界限模糊不清、肝細(xì)胞索排列紊亂，肝細(xì)胞腫脹，呈彌漫性脂肪變性，部分細(xì)胞核溶解，間質(zhì)組織大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，呈現(xiàn)片狀壞死灶，肝中央靜脈及肝竇可見部分淤血。津力達(dá)組及益氣養(yǎng)陰活血方治療各組肝臟病理?yè)p害較模型組明顯改善，肝小葉、肝細(xì)胞索基本結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞腫脹及脂肪變性較模型組減少，間質(zhì)少見炎癥細(xì)胞，淤血程度較模型組減輕，見圖1。

表1 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病大鼠FBG、2 hBG、GSP的影響（x±s）

表2 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病大鼠FINS、體質(zhì)量的影響（x±s）

3.3 各組大鼠肝臟組織miRNA－126表達(dá)水平的比較 與空白組相比，模型組及津力達(dá)組，低、中、高劑量組miRNA－126表達(dá)均升高（P<0.05）；與模型組相比，各治療組 miRNA－126表達(dá)均降低（P＜0.05）；與津力達(dá)組相比，中劑量組miRNA－126表達(dá)明顯降低（P＜0.05），見表 3。

4 討論

圖1 各組大鼠肝臟組織比較（HE×400）

表3 益氣養(yǎng)陰活血方對(duì)糖尿病大鼠肝臟組織miRNA-126表達(dá)的影響（x±s）

IR發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，而miRNA－126可對(duì)胰島素作用靶器官肝臟產(chǎn)生影響，從而改善胰島素抵抗。錢榮立等[3]發(fā)現(xiàn)在ob/ob大鼠肝臟和GK骨骼肌中，miRNA－126的含量顯著上升。何亞非[4]發(fā)現(xiàn)正常人肝細(xì)胞內(nèi)miRNA－126表達(dá)上升時(shí)，細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性下降，從而發(fā)生肝臟胰島素抵抗，葡萄糖代謝紊亂。其作用機(jī)制推測(cè)與導(dǎo)致胰島素受體后缺陷有關(guān)，胰島素受體后缺陷主要包括胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中胰島素受體功能障礙、受體底物酪氨酸磷酸化水平增強(qiáng)、PI3K和蛋白激酶B（PKB）活性下降、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4（GluT4）表達(dá)和轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻、Ras途徑異常等。張東澤等發(fā)現(xiàn)[5]過(guò)表達(dá)miRNA-126大鼠胰島β細(xì)胞株（INS-1）能夠抑制胰島素受體底物（IRS-1）、磷酸肌醇3激酶調(diào)節(jié)亞單位（PIK3R2）和蛋白激酶B（Akt）的表達(dá)水平，證實(shí) miRNA-126可能通過(guò)調(diào)控IRS-1和PI3K信號(hào)通路，從而調(diào)控胰島β細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)胰島的生長(zhǎng)發(fā)育，參與IR的發(fā)生。Ryu等[6]觀察到在肝細(xì)胞中，miRNA-126通過(guò)調(diào)控其靶基因IRS-1，導(dǎo)致IR，肝細(xì)胞內(nèi)miRNA-126的過(guò)表達(dá)，肝組織對(duì)胰島素的反應(yīng)性下降，胰島素代償性增多出現(xiàn)胰島素抵抗。

中醫(yī)多認(rèn)為氣陰兩虛兼血瘀是胰島素抵抗發(fā)生的關(guān)鍵病機(jī)，益氣養(yǎng)陰化瘀法能夠抑制大鼠體質(zhì)量下降和血糖升高，調(diào)節(jié)血清INS水平[7-8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰活血中藥可增強(qiáng)胰島素敏感性，防治胰島β細(xì)胞功能損傷[9-10]。因此，課題組在治療上確立了益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之法，自擬益氣養(yǎng)陰活血方，攻補(bǔ)兼施、標(biāo)本同治，臨床療效顯著。本實(shí)驗(yàn)選取的津力達(dá)顆粒，功效益氣養(yǎng)陰，健脾運(yùn)津，多項(xiàng)臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，可改善糖、脂代謝及胰島素抵抗[11-12]。

本研究結(jié)果可以看出，益氣養(yǎng)陰活血方可以改善血糖代謝，降低體質(zhì)量，降低空腹胰島素水平。肝臟細(xì)胞染色可以看出，津力達(dá)組及益氣養(yǎng)陰活血方治療各組肝臟病理?yè)p害較模型組明顯改善。qRTPCR結(jié)果顯示，與模型組相比，津力達(dá)組及中藥各劑量組miRNA-126表達(dá)明顯降低，益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組比津力達(dá)組降低更明顯。從而得出結(jié)論，益氣養(yǎng)陰活血方可能通過(guò)調(diào)控miRNA-126表達(dá)改善糖尿病大鼠胰島素抵抗，改善血糖代謝。另外，益氣養(yǎng)陰活血方中劑量組在降低血糖，改善肝臟細(xì)胞病理形態(tài)，降低肝臟細(xì)胞miRNA-126表達(dá)方面療效優(yōu)于其他中藥各組，提示影響藥物療效的關(guān)鍵還有藥物劑量，以達(dá)到最優(yōu)效果的劑量為宜，并非劑量越大越好，但關(guān)于中藥尤其是中藥復(fù)方的量效關(guān)系有待進(jìn)一步深入研究。

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