傅文源

(福建梅花山華南虎繁育研究所，龍巖，364201)

糞便的主要成分包括食物殘?jiān)?、腸道微生物、脫落的腸上皮細(xì)胞、細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物、電解質(zhì)以及微量的激素等。野生動(dòng)物研究中，因?yàn)槭占S便相對(duì)容易，且不損傷動(dòng)物，所以，糞便成分分析就成為常用研究手段，如分析動(dòng)物的食性［1－2］、腸道微生物群落結(jié)構(gòu)［3］、寄生蟲［4］、病原體［5］、DNA 信息［6］、礦物質(zhì)元素［7］等。此外，激素是糞便分析的一個(gè)重要方面，通過分析腎上腺皮質(zhì)激素來了解動(dòng)物的應(yīng)激性［8－9］，以及通過性激素的分析來判斷動(dòng)物的繁殖生理狀態(tài)［10－14］都是常見的研究策略。

糞便激素分析受到很多因素的影響，如糞便不同部位激素的含量存在差異［15］，糞便所處的環(huán)境溫度、濕度、從排出到采集的時(shí)間長短以及是否受到尿液或其他污染［16］等，也是造成激素含量波動(dòng)的主要原因。

虎(Panthera tigris)是重要的瀕危物種，性情兇猛，研究其繁殖活動(dòng)時(shí)，主要依據(jù)糞便中的性激素含量［12］?；⒌募S團(tuán)較大，且含有較多的毛發(fā)，基本具備了與大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)糞便類似的結(jié)構(gòu):表層含有更多的腸道脫落細(xì)胞和黏膜碎片。如果像大熊貓一樣［15］，糞團(tuán)內(nèi)激素非均一分布，則激素分析時(shí)樣品擇取部位就會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。動(dòng)物的生理具有明顯的日節(jié)律。如果一天之內(nèi)不同時(shí)間排出的糞便激素含量存在較明顯的差異，那么，這直接就會(huì)成為用糞便激素來監(jiān)測動(dòng)物生理狀況時(shí)的一個(gè)影響因素。此外，虎時(shí)而會(huì)排出巧克力狀糞便，這類糞便中的激素含量也可能與正常糞便有所不同。但是，上述因素的影響在虎的糞便激素分析中尚未被系統(tǒng)評(píng)估，進(jìn)而影響對(duì)激素檢測結(jié)果的解析。

本研究以人工飼養(yǎng)的東北虎(P.t.altaica)和華南虎(P.t.amoyensis)的糞便為材料，針對(duì)糞便的不同部位、采集時(shí)間、糞便含水量這3個(gè)因素，研究其對(duì)性激素分析效果的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

2013年5月中旬至12月底，從上海動(dòng)物園、福建梅花山華南虎繁育研究所采集9只成年雌性華南虎糞便樣品;2013年1月上旬至2014年3月上旬，從黑龍江東北虎林園采集18只成年雌性東北虎糞便樣品;2014年6月底至9月中旬從中國橫道河子貓科動(dòng)物飼養(yǎng)繁育中心采集6只成年雌性東北虎糞便樣品。所有的虎都曾繁殖過至少1胎，處于較佳的健康狀態(tài)。

1.2 糞便樣品的采集

采集前一天將內(nèi)舍地面用清水沖洗干凈，傍晚把虎收回舍內(nèi)，翌日清晨5:00開始檢查排便情況。在糞便排出后30 min內(nèi)采集完畢。操作時(shí)，用鑷子夾取糞團(tuán)，小心裝入封口袋中。每采集一次，鑷子用衛(wèi)生紙和酒精棉擦拭干凈。用油性記號(hào)筆在封口袋上標(biāo)記虎的編號(hào)、采集日期和地點(diǎn)等信息。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)記錄本上記錄糞便樣品的基本信息，包括采集地點(diǎn)、虎的編號(hào)、采集日期、溫度、糞便形狀、干燥和稀便等。采集后將樣品袋放入冷藏箱中暫存2～3 h后，轉(zhuǎn)入－20℃冰柜內(nèi)保存。

1.3 糞便類固醇激素的提取與測定

1.3.1 糞便類固醇激素的提取

糞便中孕酮、雌二醇、睪酮等類固醇激素的提取參考郎冬梅等［17］、李瓊［18］提取激素的方法，并進(jìn)行了改進(jìn)。將糞便從－20℃冰柜中取出，室溫下解凍。剔除毛發(fā)、骨頭碎片、植物碎片等雜物后，置于研磨缽中，充分研磨粉碎并混合均勻。用電子天秤稱取約1.5 g樣品于15 mL離心管中，加入10 mL濃度為90%的甲醇溶液，在渦旋震蕩儀上充分震蕩1 min，置于60℃的恒溫水浴鍋中溫浴20 min。之后在離心機(jī)中以2000 rpm離心10 min，取上清液于新的離心管中，置于－20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

同時(shí)，取大小約為10 cm ×10 cm的潔凈牛皮紙若干，于105℃下烘至恒重。取10 g左右同一糞便樣品，放置于已知重量的牛皮紙上，在分析天平上準(zhǔn)確稱重后，扣除牛皮紙的重量，得到糞便的濕重。將糞便放入烘箱中105℃烘至恒重，然后計(jì)算糞便含水量。再按照含水量推算每份提取激素的糞便樣品的干重，用于計(jì)算激素含量(ng/g_dry或μg/g_dry)作為最終結(jié)果。

1.3.2 類固醇激素的測定方法

采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)測定上述各待測樣品。測量前將孕酮、雌二醇和睪酮待測樣品用pH=7.4的0.02 mol/L的磷酸緩沖液稀釋5×，然后用96孔酶聯(lián)免疫診斷試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)對(duì)睪酮和雌二醇進(jìn)行測量，操作按照說明書進(jìn)行。先重復(fù)測定2個(gè)數(shù)據(jù)，遇到有兩個(gè)結(jié)果相差較大的數(shù)據(jù)重新檢測。

所用試劑盒主要參數(shù)包括:孕酮測定范圍0～20 ng/mL，靈敏度≤0.005 ng/mL，變異系數(shù)CV＜15%，與孕酮、雌二醇、DHT沒有交叉反應(yīng);雌二醇測定范圍0～1000 pg/mL，靈敏度≤25 pg/mL，變異系數(shù)CV＜15%，與孕酮、雌三醇無交叉反應(yīng);睪酮測定范圍0～20 ng/mL，靈敏度≤0.005 ng/mL，變異系數(shù)CV＜15%，與孕酮、雌二醇、DHT沒有交叉反應(yīng)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Microsoft Excel 2003對(duì)每個(gè)樣品測得的OD450nm值進(jìn)行初步整理，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程用OD值計(jì)算出激素的濃度值，然后根據(jù)糞便樣品的干重計(jì)算出干糞中所含測量指標(biāo)的濃度，其中每種激素在檢測時(shí)均符合標(biāo)準(zhǔn)曲線，r2值均大于0.98，證明ELISA方法可靠。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)的特征用均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表現(xiàn)。

因?yàn)闃悠凡杉瘯r(shí)間跨度較長，為了消除虎生理時(shí)期激素水平的影響［19］，均采用同一個(gè)樣品不同部位之間的比較，或者同一只個(gè)體同一天上午和下午所排糞便之間進(jìn)行比較。多重比較采用單因素重復(fù)測量方差分析(One-way repeat measure anova)，首先通過箱式圖的方法對(duì)3個(gè)部位的激素含量是否有異常值進(jìn)行檢驗(yàn)，通過Shapiro-Wilk方法對(duì)是否近似符合正態(tài)分布進(jìn)行檢驗(yàn)，采用Mulchily's test檢驗(yàn)是否符合球形假設(shè)。對(duì)不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)通過Log轉(zhuǎn)換進(jìn)行正態(tài)化后再進(jìn)行檢驗(yàn)。最后，進(jìn)行單因素重復(fù)測量多重比較，置信度進(jìn)行 Bonferroni校正，即 α=0.05/2=0.025。以Pearson's correlation test進(jìn)行雙變量相關(guān)分析，顯著性水平均設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 糞便不同部位3種類固醇激素的含量差異

本部分研究以2013年5月中旬至12月底，從上海動(dòng)物園、福建梅花山華南虎繁育研究所采集的9只成年雌性華南虎糞便樣品為材料。對(duì)糞便表層及內(nèi)部的3種類固醇激素水平測定結(jié)果如圖1A。糞團(tuán)表層睪酮含量為(99.38±35.52)ng/g干重，中層含量為(102.92±51.74)ng/g干重，中心的含量為(77.49±31.07)ng/g干重。通過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)正態(tài)化后進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)(χ2=0.345，P=0.841)，且各個(gè)水平總體上無顯著差異(F=1.614，P=0.239)。多重比較顯示，糞便表層與中層之間(P=1.000)、中層與中心之間(P=0.282)、表層與中心之間(P=0.824)亦均無顯著差異。

糞團(tuán)表層雌二醇含量為(421.84±104.19)ng/g干重，中層含量為(293.72±158.68)ng/g干重，中心的含量為(365.72±125.33)ng/g干重。通過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)正態(tài)化后進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)(χ2=2.239，P=0.326)，且各個(gè)水平總體上無顯著差異(F=1.581，P=0.253)。多重比較顯示，糞便表層與中層之間(P=0.316)、中層與中心之間(P=1.000)、表層與中心之間(P=1.000)亦均無顯著差異，如圖1B。

糞團(tuán)表層孕酮含量為(2.04±2.27)μg/g干重，中層含量為(1.04±0.96)μg/g干重，中心的含量為(2.12±2.14)μg/g干重。通過對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換將數(shù)據(jù)正態(tài)化后進(jìn)行單因素重復(fù)測量方差分析，結(jié)果顯示，數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)(χ2=5.595，P=0.061)，且各個(gè)水平總體上無顯著差異(F=1.511，P=0.267)。多重比較顯示，糞便表層與中層之間(P=0.128)、中層與中心之間(P=1.000)、表層與中心之間(P=1.000)亦均無顯著差異，如圖1C。

圖1 華南虎糞團(tuán)不同部位3種類固醇激素含量的差異Fig.1 Comparisons of the contents of three steroid hormones among different sections of the south China tiger fecal pellets

以上結(jié)果顯示，睪酮在糞團(tuán)中的分布呈現(xiàn)出從外層到中央逐漸遞減的趨勢，但是相鄰部分之間無顯著差異，說明是一種漸變的狀態(tài)。其他兩種激素并未呈現(xiàn)出這種趨勢。因此，為了在實(shí)際操作中減少測定結(jié)果的變異性，后續(xù)試驗(yàn)中將糞便進(jìn)行了均質(zhì)化處理，即將整個(gè)糞團(tuán)進(jìn)行攪拌混勻后隨機(jī)獲取分析樣品。

2.2 采集時(shí)間對(duì)激素含量測定結(jié)果的影響

本部分研究以2014年6月底至9月中旬在中國橫道河子貓科動(dòng)物飼養(yǎng)繁育中心采集6只雌虎糞便樣品為材料，同一個(gè)體分別采集了上午(8:30～10:30)和下午(15:00～17:00)兩個(gè)時(shí)間段排出的糞便，經(jīng)過均質(zhì)化處理后隨機(jī)采樣進(jìn)行激素檢測。

對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)雌二醇含量在上午和下午之間無顯著相關(guān)性(r=0.384，P=0.523)，同時(shí)檢測到雌二醇含量在上午略高于下午，但未達(dá)到顯著差異(均值上午=(17.797±21.899)μg/g_dry，均值下午=(6.678±3.731)μg/g_dry，t=1.198，P=0.297)。也就是說，雌二醇水平的高與低與上、下午采集的糞便沒有直接的關(guān)聯(lián)性，也沒有明顯的差異性。

與雌二醇相反，孕酮含量在上午糞便和下午糞便之間有著極顯著的相關(guān)性(r=0.992，P=0.001)。同時(shí)，上午糞便中的含量顯著高于下午糞便的含量(均值上午=(5189.992±7365.555)ng/g_dry，均值下午=(3612.589 ±7136.482)ng/g_dry，t=3.765，P=0.020)。

糞便中睪酮含量在上午和下午之間有著極顯著的相關(guān)性(r=0.989，P=0.001)，上午樣品的含量略高于下午，但是未達(dá)到顯著水平(均值上午=(287.096±465.516)ng/g_dry，均值下午=(129.901±234.442)ng/g_dry，t=1.487，P=0.211)。

這一結(jié)果顯示，糞便排出后，在環(huán)境中存放時(shí)間對(duì)性激素的水平存在一定的影響，因?yàn)榇蟛糠只⒍荚诔块g排便，而且該糞便是上一次排便后至本次排便前大約24 h積累效應(yīng)，因此更為有效。下午所排糞便有的是一天之內(nèi)的首次排便，有的是第2次排便。因此二者之間有著較大的差異。鑒于大部分虎都是早上排便，而早晨所排糞便中激素含量較高，有利于分析動(dòng)物的生理狀態(tài)，建議采用上午采集的糞便作為正式試驗(yàn)的樣品。

2.3 糞便的性狀對(duì)測定結(jié)果的影響

因?yàn)榛⒌募S便經(jīng)常在同一糞團(tuán)上，有些部分比較干燥、成形，而另一部分水分較大，比較黏稠，且無固定形狀。選取2013年1月上旬至2014年3月上旬從黑龍江東北虎林園采集18只成年雌性東北虎糞便樣品，研究糞便中較干的有形部分和較為黏稠的無形部分進(jìn)行激素含量的比較分析。從變化趨勢上看，有形部分和無形部分的雌二醇含量之間沒有顯著的相關(guān)性(r=0.132，P=0.602)，而孕酮和睪酮兩種激素在有形和無形的部分則有著極為顯著的相關(guān)性(r孕酮=0.800，P=0.000;r睪酮=0.797，P=0.000)。

經(jīng)配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雌二醇在糞便有形部分均值為(232.093±178.807)μg/g_dry，無形部分均值為(276.713±152.542)μg/g_dry，二者之間無顯著差異(t=－0.864，P=0.400)。孕酮含量在有形部分均值為(10.171±14.100)μg/g_dry，無形部分均值為(8.025±9.669)μg/g_dry，二者之間無顯著差異(t=0.974，P=0.344)。睪酮含量在有形部分均值為(101.654±140.000)ng/g_dry，無形部分均值為(69.452±42.653)ng/g_dry，二者之間無顯著差異(t=0.928，P=0.366)。

3 討論

糞便的形成在大腸后段，主要成分是食物殘?jiān)⒓?xì)菌和腸道脫落物等。在糞便形成早期，隨著腸道的蠕動(dòng)，各類組分得到充分混合，而進(jìn)入腸道后段隨著水分重吸收，逐漸成形、硬化。硬化后的糞便會(huì)在腸道內(nèi)保存較長時(shí)間，此時(shí)糞便一部分與腸管有不同程度的接觸，而有些部分則再無機(jī)會(huì)與腸管接觸，至此，就會(huì)形成結(jié)構(gòu)性差異，進(jìn)而影響類固醇激素的分布，這在很多草食動(dòng)物的研究中得到證實(shí)。譬如大熊貓糞團(tuán)中不同部位雌二醇、睪酮、皮質(zhì)醇激素的含量不同［15］。

可以推測，糞便中的類固醇激素主要來源于腸組織，其濃度與血液中同種激素的水平直接相關(guān)［20］?？梢酝茰y，隨著時(shí)間的延長，與腸黏膜直接接觸的糞便表層可能積累較多的激素，而糞便中心部分則含量相對(duì)較少。本研究的結(jié)果顯示，睪酮、雌二醇和孕酮的含量在糞便表層、中層和中心之間未檢測到顯著差異(P=0.061～0.253，圖1)，這提示，在檢測雌虎糞便中類固醇激素含量時(shí)，可以不考慮不同部位的含量差異。因?yàn)榛⒓S便含有大量被毛時(shí)，結(jié)構(gòu)相當(dāng)緊實(shí)，刻意獲取外層糞便時(shí)操作比較復(fù)雜。所以，不考慮部位差異性可以提高操作的便捷性。

糞便在比較溫和的環(huán)境中(如室溫條件下)存放時(shí)間長短對(duì)激素含量的影響已有很多研究。糞便中的孕酮在室溫下24 h內(nèi)會(huì)發(fā)生顯著的降解［21］。在有氧狀態(tài)下雌二醇的半衰期僅為4～12 h，而在無氧環(huán)境下降解極為緩慢［22］。當(dāng)新鮮糞便暴露在空氣中時(shí)，最外面的激素處于有氧狀態(tài)下，如果未能立即進(jìn)行無氧處理，都會(huì)在短期內(nèi)喪失殆盡。而表面以下的激素，如果糞團(tuán)比較緊密而處于無氧狀態(tài)，就會(huì)得到有效保留，如果比較松散，則會(huì)逐漸降解。一些實(shí)驗(yàn)無論在室溫下還是在低溫下保存糞便都發(fā)現(xiàn)較多的降解，可能與此有關(guān)［23－26］。同時(shí)，激素在腸道和糞便中的消解主要因?yàn)槲⑸锏淖饔茫?7］，因此，樣品保存中通過低溫等方式抑制微生物的活力是非常必要的。

虎夜間排便較少，更多的是在清晨。此時(shí)的糞便應(yīng)該在腸道存留時(shí)間較長，積累的激素總量可能較多。那么在腸道期間就會(huì)形成一邊積累、一邊消解的動(dòng)態(tài)局面。如果糞便中檢測到較高的激素水平，表明激素分泌和累積的速度整體上高于消解的速度。下午所排糞便往往是在上午排便之后重新形成的，激素累積時(shí)間較短，則其表觀的激素水平就會(huì)略低。本研究中，3種類固醇激素在上午所排糞便中的含量均略高于下午所排糞便，符合這一趨勢，但只有孕酮達(dá)到了顯著水平(t=3.765，P=0.020)，所以，除了孕酮之外，另外兩種激素并不太受排便時(shí)間的影響。所以，如果只檢測雌二醇和睪酮時(shí)，則采用上午或下午的糞便均可，但要檢測孕酮，則必須確定一個(gè)一致的糞便排出時(shí)間，避免更多的誤差。在實(shí)際工作中，因?yàn)榇蠖鄶?shù)虎都會(huì)在早晨排便，為了便捷起見，可以統(tǒng)一采用早晨排出的糞便。

糞便含水量的差異一直是影響激素檢測的重要因素。因此，為了消除含水量引起的誤差，最后都統(tǒng)一換算成單位干重糞便中的含量［15］。從糞便形成過程來看，含水量越高，糞便越稀，表明在腸道中保留的時(shí)間越短，激素積累的量會(huì)越少。但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果否定了這一推測，同一個(gè)糞便中較干燥的部分和較黏稠的部分中，類固醇激素含量沒有顯著差異。也就是說，糞便激素只要積累時(shí)間和消解速度一致，無論含水量多高，換算成干重含量時(shí)檢測結(jié)果不受影響。

綜合上述結(jié)果，我們建議在通過糞便監(jiān)測虎類固醇激素水平時(shí)，首先要確定糞便采集的時(shí)間，最好采集早晨的糞便;第二，鑒于激素分布有差異傾向，以及不同含水量對(duì)干重含量沒有影響，建議分析時(shí)將整個(gè)糞便樣品做均質(zhì)化處理，然后隨機(jī)取樣。

致謝:本研究中東北林業(yè)大學(xué)的石許秀、馬躍、徐艷春等在實(shí)驗(yàn)中提供了很多幫助，上海動(dòng)物園的袁耀華、劉群秀、李清，黑龍江東北虎林園的劉丹、馬國慶，福建梅花山華南虎繁育研究所的林開雄、蘭作閩等在樣品采集中給予了大力協(xié)助，在此對(duì)上述單位和個(gè)人表示衷心感謝。

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