葛寶慶 胡素賢 孫鐵鐸 張崇穎 姜廣順

(1.國家林業(yè)局貓科動物研究中心;東北林業(yè)大學野生動物資源學院，哈爾濱，150040;2.東北林業(yè)大學圖書館，哈爾濱，150040;3.吉林省林業(yè)勘察設計研究院，長春，130021;4.吉林省天橋嶺林業(yè)局，汪清，133204)

野豬(Sus scrofa)，隸屬于哺乳綱、偶蹄目(Artiodactyla)、豬科(Suidae)、豬屬動物，共有8屬22種［1］，其分布范圍廣泛，以歐洲、亞洲與非洲分布最廣，在半干旱氣候至熱帶雨林、溫帶林地、草原等都有其分布，但是在極為干旱、海拔極高與寒冷的地區(qū)難以發(fā)現(xiàn)其蹤跡。除戈壁沙漠與青藏高原外，在中國境內(nèi)均有野豬分布，野豬主要集中分布在東北三省、云貴地區(qū)、福建、廣東地區(qū)。其中分布在中國東北的是烏蘇里野豬(S．s．ussuricus)。近年來，由于棲息地質(zhì)量下降與人為獵殺，野豬種群數(shù)量在逐漸減少［2］。

對野豬種群數(shù)量和種群特征的監(jiān)測是野豬種群資源管理的重要內(nèi)容。傳統(tǒng)的野生動物種群監(jiān)測和管理技術，包括直接觀察、個體計數(shù)、足跡識別、測量跟蹤和記錄獵物［3］。但這些傳統(tǒng)技術幾乎是不可能為精確管理方法，如性別比例、個體間關系、遺傳多樣性、種群分化、亞種群間基因流和近親繁殖或遠親繁殖水平，提供所需的關鍵信息。從而，野生動物的保護研究逐漸從宏觀的研究手段過渡到微觀手段，來揭示野生動物種群資源動態(tài)的特征。

遺傳多樣性能夠反應遺傳變異的水平，是衡量種群生存、進化以及對環(huán)境條件適應的關鍵指標。棲息地質(zhì)量的下降以及強烈的人為活動會在分子、細胞與個體水平上對動物產(chǎn)生影響，造成動物遺傳變異水平下降。遺傳多樣性水平的下降將會削弱動物對環(huán)境的適應能力，導致動物擴散遷移能力降低，近交程度增加，動物個體生存能力下降。目前使用分子標記技術研究野豬的種群遺傳學還較少。如蘭宏等利用線粒體DNA序列分析了西南地區(qū)家豬和野豬遺傳多樣性［4］，Vernesi等使用微衛(wèi)星標記分析了在種群數(shù)量減少和重引入對野豬的遺傳影響［5］，李崇奇采用線粒體變異探討了野豬系統(tǒng)地理學和家豬起源［6］，張晨嶺使用微衛(wèi)星標記探討了中國大陸地區(qū)野豬的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，表明了中國大陸地區(qū)的野豬較國外野豬有更高的遺傳多樣性［7］。同樣，霍金龍等使用76個微衛(wèi)星標記對云南南部地區(qū)野豬群體的遺傳多樣性進行評估，也表明該野豬群體遺傳多樣性較豐富［8］。韓春梅等使用mtDNA控制區(qū)序列評估了新疆野豬遺傳多樣性，闡明了新疆野豬與亞洲野豬和國內(nèi)地方豬種之間的遺傳關系較近［9］。然而，關于東北地區(qū)野豬種群遺傳多樣性的研究較少。本研究通過采集長白山北部5個林區(qū)的野豬糞便樣本，結(jié)合微衛(wèi)星標記技術，評估長白山北部區(qū)域野豬種群的遺傳多樣性水平和近交程度，為制定野豬種群保護和利用策略提供遺傳基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及保存

2014～2016年期間，在長白山北部的5個采樣地點采用系統(tǒng)布樣的設計方法，分別在汪清自然保護區(qū)共布設19條樣線，張廣才嶺南部林區(qū)共布設25條樣線，琿春自然保護區(qū)共布設18條樣線，天橋嶺自然保護區(qū)共布設20條樣線，穆棱林區(qū)中共布設19條長度大于5 km的樣線，尋找野豬足跡。

在樣線上發(fā)現(xiàn)新鮮的野豬足跡后，沿著足跡鏈跟蹤，保證跟蹤距離達到3 km以上。在跟蹤足跡的過程中，為避免重復取樣，在一條野豬足跡鏈上只采取一堆糞便樣本。用一次性PE手套將糞便樣品裝入封口袋中，并記錄采樣時間、地點、足跡鏈編號、經(jīng)緯度及采集人。每次收集糞便時要更換PE手套和收集袋，避免交叉污染。由于冬天研究地區(qū)的溫度大多低于－20℃，所以收集到的糞便樣品可直接放在室外陰暗處保存。糞便樣品從野外采集結(jié)束后，將糞便樣品送回實驗室，在－20℃的低溫冰箱中冷凍保存。

在5個地點共收集疑似野豬糞便樣品140份，其中汪清(WQ)共計36份，琿春(HC)共計35份，張廣才嶺南(ZGCLN)共計23份，天橋嶺(TQL)共計27份，穆棱(ML)共計19份。

1.2 DNA提取

DNA Stool Mini Kit試劑盒(產(chǎn)自德國QIAGEN公司)對糞便樣本提取DNA。使用苯酚－氯仿抽提法提取野豬肌肉樣本 DNA。在 4℃或者 －20℃下保存DNA。

1.3 特異性引物及微衛(wèi)星位點信息

SSR(simple sequence repeats，簡單重復序列)，又稱微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA)，是指含有1～6個堿基對的短串聯(lián)重復DNA序列，常見的是雙核苷酸重復，如(CA)n和(TG)n。微衛(wèi)星DNA重復單位數(shù)目為10～60個，重復單元數(shù)目的差異和重復程度的不同造成微衛(wèi)星DNA片段長度差異，差異使得同一基因座位在一物種中存在很多的等位基因，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性［10］。微衛(wèi)星DNA由于其多態(tài)性高，信息量大，實驗步驟少且簡單，實驗結(jié)果穩(wěn)定，DNA需求量少等優(yōu)點，廣泛應用于遺傳學分析。本研究采用世界糧農(nóng)組織(FAO)推薦的適于野豬遺傳學分析的9個微衛(wèi)星標記。

使用野豬特異性引物進行物種鑒定，上游引物序列為5'-GACTAGGAACCATGAGGTTGCG-3'，下游引物序列為5'-AGCCTACACCACAGCCACAG-3'，擴增片段大小為134 bp，PCR擴增時退火溫度為63℃［11］。微衛(wèi)星位點信息見表1。所有引物都由上海生工生物有限公司合成。

表1 微衛(wèi)星位點信息Tab.1 Microsatellite markers information

1.4 PCR擴增及電泳檢測

PCR擴增的反應體系為 Buffer 10 μL、dNTPs 4 μL、Taq 酶 0.3 μL、上游引物 0.75 μL、下游引物0.75 μL、DNA 1 μL，用 ddH2O 補足體系到 20 μL。

PCR循環(huán)參數(shù)為:94℃，預變性2 min后;98℃，變性20 s;在各引物退火溫度下，退火30 s;68℃ 延伸20 s;擴增35個循環(huán)后，最后以68℃延伸10 min。4℃保存。擴增產(chǎn)物在含有核酸染料Golden View的1%瓊脂糖凝膠中，以120 V的電壓電泳30 min。最后在UVP凝膠成像系統(tǒng)上紫外透射觀察，照相，保存。每個樣本進行PCR擴增3～5次，以確保實驗結(jié)果的準確性。

使用ABI3730X1測序儀對所有微衛(wèi)星位點熒光標記下的PCR擴增產(chǎn)物進行基因型分型?；蛐团凶x時，若3次PCR擴增中，出現(xiàn)3次復等位基因則判斷為雜合子。若不能判斷為雜合子，則再進行PCR擴增，根據(jù)多次結(jié)果，判斷為純合子還是雜合子。若多次擴增之后，仍無法判斷，則舍棄樣本。

1.5 統(tǒng)計分析

使用Excel的Microsatellite Toolkit進行個體鑒定。使用Gimlet軟件計算微衛(wèi)星位點的個體聯(lián)合判別率。使用GenAIEx計算如下遺傳參數(shù):等位基因頻率、有效等位基因數(shù)(Ne)，Hardy-Weinberg平衡檢驗、雜合度、多態(tài)信息含量(PIC)、Shannon指數(shù)和F－統(tǒng)計值。

2 結(jié)果

2.1 個體判別率

使用Gimlet軟件，得到9個微衛(wèi)星位點的個體聯(lián)合判別率，結(jié)果見表2。如圖1所示，當聯(lián)合使用前5個微衛(wèi)星位點分析時，就可以進行無偏差個體判別。當使用前7個微衛(wèi)星位點分析時，就可以達到全同胞個體判別的要求。本文使用的9個微衛(wèi)星位點對樣本進行個體鑒別時，全同胞基因型相似概率為0.0001415。研究采用的9個微衛(wèi)星位點能滿足個體判別的需要。

表2 微衛(wèi)星位點個體判別率和多態(tài)信息含量(PIC)Tab.2 PI-idiotype similar probability and polymorphism information content(PIC)

9個微衛(wèi)星位點PIC值結(jié)果見表2。微衛(wèi)星位點PIC最小值為0.625(SW857)，最大值為0.888(S0226)。所有微衛(wèi)星位點的PIC值均大于0.5，表明本研究使用的微衛(wèi)星位點都為高度多態(tài)性位點，可以滿足實驗要求。

2.2 物種鑒定和個體數(shù)量

使用物種特異性引物對收集到的140份糞便樣本進行物種鑒定時，只有32號、62號糞便樣本在瓊脂糖凝膠電泳實驗時沒有檢測到有效的條帶。利用微衛(wèi)星引物進行PCR擴增時，有些樣本無法得到有效的擴增片段，故舍棄掉這些樣本不用于接下來的遺傳分析。

使用Excel中的Microsatellite Toolkit對101份野豬DNA進行個體鑒定。經(jīng)鑒定，琿春有23個野豬個體，張廣才嶺南有14個野豬個體，汪清有19個野豬個體，天橋嶺有13個野豬個體，穆棱有16個野豬個體。

2.3 等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)(Ne)和基因頻率

9個微衛(wèi)星標記得到的等位基因數(shù)及各種群實際等位基因數(shù)(Na)和有效等位基因數(shù)(Ne)結(jié)果見表3。

表3 各種群9個微衛(wèi)星位點的實際等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)和等位基因數(shù)目(k)Tab.3 The number of actual alleles(Na)，effective alleles(Ne)for different combinations of locus-population and for each population，number of alleles for each loci

9個微衛(wèi)星標記得到的等位基因數(shù)變化范圍為6～15個，SW857位點的等位基因數(shù)最少，S0101位點的等位基因數(shù)最大。S0005位點在222 bp上的等位基因頻率最高，為0.65625。整體來看，所有種群的平均實際等位基因數(shù)量中，天橋嶺種群的平均實際等位基因數(shù)最小，為5.444個，穆棱種群的平均等位基因數(shù)最大，為8個。所有種群的平均有效等位基因數(shù)量中，天橋嶺種群的平均有效等位基因數(shù)最小，為3.368個，穆棱種群的平均有效等位基因數(shù)最大，為5.144個。

本研究中的5個種群中，琿春種群Ne與Na之間差異最大的位點為S0005位點(5.624)，張廣才嶺南種群中Ne與Na之間差異最大的位點為S0227位點(3.574)，汪清種群中Ne與Na之間差異最大的位點為SW72(5.624)，天橋嶺種群中Ne與Na之間差異最大的位點為S0226位點(4.721)，穆棱種群中Ne與Na之間差異最大的位點為S0090位點(5.150)。

2.4 雜合度

各種群9個微衛(wèi)星位點的表觀雜合度、期望雜合度及平均雜合度，結(jié)果見表4。在5個種群中，天橋嶺種群平均期望雜合度最小，為0.687，琿春種群平均期望雜合度最大，為0.766。張廣才嶺南種群平均表觀雜合度最小，為0.762，穆棱種群平均表觀雜合度最大，為0.813。平均表觀雜合度均大于平均期望雜合度。

表4 各種群9個微衛(wèi)星位點的表觀雜合度(Ho)和期望雜合度(He)及平均雜合度Tab.4 The observed heterozygosity(Ho)，the expected heterozygosity(He)and mean heterozygosity different combinations of locus-population and for each population

2.5 Hardy-Weinberg平衡檢驗

各種群每個位點Hardy-Weinberg平衡檢驗的P值及顯著性結(jié)果見表5。9個微衛(wèi)星位點Hardy-Weinberg平衡檢驗中，琿春種群的S0226位點，P值為0.011(＜0.05);張廣才嶺南種群的S0101位點，P值為0.023(＜0.05);汪清種群的S0005位點和S0101位點，P值都為0.000(＜0.001);天橋嶺種群的SW72位點，P值為0.020(＜0.05);穆棱種群的S0225位點，P值為0.034(＜0.05)，這些位點顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。各種群的其余位點未顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。5個種群的45個Hardy-Weinberg平衡檢驗中，共有6個(約13.3%)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。

表5 各種群9個微衛(wèi)星位點的Hardy-Weinberg平衡卡方檢驗的P值及顯著性Tab.5 P value and significance of Hardy-Weinberg equilibrium

2.6 Shannon指數(shù)

各種群9個位點Shannon指數(shù)的平均值中，天橋嶺種群的平均Shannon指數(shù)最小，為1.359，穆棱種群的平均Shannon指數(shù)最大，為1.729，琿春種群平均Shannon指數(shù)為1.688，張廣才嶺南種群平均Shannon指數(shù)為1.580，汪清種群平均 Shannon指數(shù)為1.532。

2.7 F－統(tǒng)計值

9個微衛(wèi)星位點的F－統(tǒng)計值(Fis、Fit、Fst)結(jié)果見表6。在9個位點中，F(xiàn)is值的范圍在－0.206到0.074之間，只有S0005微衛(wèi)星位點的Fis值大于0，其余8個微衛(wèi)星位點的Fis值均小于0。

3 討論

多態(tài)信息含量(PIC)作為衡量微衛(wèi)星位點多態(tài)性的重要指標。本研究采用的9個微衛(wèi)星位點的PIC值變化范圍在0.625(SW857)～0.888(S0226)，PIC值均大于0.5。根據(jù)Botstein等的建議，當PIC＞0.5時，位點為高度多態(tài)性位點［12］。因此，本研究所采用的9個微衛(wèi)星位點都為高度多態(tài)性位點，這就滿足了遺傳多樣性研究要求，研究結(jié)果更為可靠。同時，每一個位點的等位基因數(shù)目的大小也能表明所篩選的微衛(wèi)星位點是否適合研究該物種的遺傳多樣性。本研究中的9個微衛(wèi)星位點，等位基因數(shù)目的變化范圍在6(SW857)～15(S0101)個。9個微衛(wèi)星位點得到的等位基因數(shù)目比較多，表明了所選位點能正確評價群體間的遺傳關系，所有的微衛(wèi)星位點都適合于分析野豬的遺傳多樣性。然而，霍金龍等［8］評估云南南部地區(qū)野豬遺傳多樣性時，采用76個微衛(wèi)星標記探測到等位基因數(shù)目在3～9個之間，微衛(wèi)星標記的PIC值在0.3701～－0.8624，小于本研究的9個微衛(wèi)星標記的PIC值及等位基因數(shù)目。

有效等位基因數(shù)(Ne)是一個衡量遺傳變異程度的指標。Ne與Na之間的差異，能說明某等位基因在群體內(nèi)分布的均勻程度。當Ne與Na之間的差異越小，表明該等位基因在群體內(nèi)分布的均勻度越好。琿春種群的S0005位點、張廣才嶺南種群的S0227位點、汪清種群的SW72位點、天橋嶺種群的S0226位點和穆棱的S0090位點，等位基因的均勻度較其他的8個微衛(wèi)星位點較差。

雜合度是衡量遺傳多樣性的一個重要指標。本研究中，各微衛(wèi)星位點的表觀雜合度在0.478～1.000之間，期望雜合度在0.494～0.889之間。這與霍金龍等［8］得到的76個微衛(wèi)星標記的表觀雜合度在0.409～1.000之間和期望雜合度在0.406～0.8765之間相一致。本研究的5個種群的平均表觀雜合度都大于平均期望雜合度。這表明種群雜合子比例較高，發(fā)生近交的可能性少，遺傳一致性較低，群體遺傳多樣性較高。

F－統(tǒng)計量是用來衡量種群遺傳差異程度的指標。Fis是指亞群體的固定指數(shù)，F(xiàn)it是指總?cè)后w的固定指數(shù)，F(xiàn)st是指亞群體間的基因分化率。本研究中的9個微衛(wèi)星位點的Fis值變化范圍為－0.206(SW857)到0.074(S0005)。所有微衛(wèi)星位點的Fis值均小于Fit值。9個微衛(wèi)星位點的平均Fis值為－0.073，平均Fit值為－0.007，平均Fst值為0.062。這就表明總?cè)后w比亞群間更穩(wěn)定，即5個種群之間存在一定程度的分化。同時，F(xiàn)is也是衡量雜合子水平的指數(shù)。Fis值的變化范圍在－1到1之間。當Fis大于0時，表明群體內(nèi)的雜合子水平較低，純合子水平較高;當Fis小于0時，表明群體內(nèi)的雜合子水平較高，純合子水平較低。張晨嶺［7］使用11個微衛(wèi)星標記計算得中國6個區(qū)域野豬種群的Fis值在0.06～0.20之間，野豬群體內(nèi)部的純合子多，雜合子少。而本研究Fis值大部分為負值，表明了沒有呈現(xiàn)雜合子缺乏的情況，近交程度較低。

Shannon指數(shù)是反映群體離散程度的一個重要指標。Shannon指數(shù)普遍變化范圍為1.5到3.5［13］。本研究中種群Shannon指數(shù)平均值最大的為1.729(穆棱)，平均值最小的為1.359(天橋嶺)。Shannon指數(shù)越大，表明群體的離散程度越高，群體遺傳多樣性越高。這就表明，從Shannon指數(shù)來看，群體遺傳多樣性從高到低，依次為穆棱、琿春、張廣才嶺南、汪清、天橋嶺。總體來說，5個種群的Shannon指數(shù)都較高，表明受近交的影響較小。

根據(jù)Hardy-Weinberg平衡定律，其假設的群體是一個理想群體，該理想群體在隨機交配的過程中，種群中的基因頻率和基因型頻率不變。本研究中，Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗結(jié)果可以看出，各種群的9個微衛(wèi)星位點，只有少部分微衛(wèi)星位點處于偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)很可能是群體并不符合隨機交配，受到物種突變、遷移等影響。

4 結(jié)論

本研究初步篩選出了長白山北部野豬遺傳多樣性的微衛(wèi)星標記。所篩選的9個微衛(wèi)星位點在遺傳學分析應用中獲得的結(jié)果可靠。通過使用所篩選的微衛(wèi)星位點對長白山北部野豬種群進行遺傳多樣性分析，表明5個區(qū)域的種群均具有較豐富的遺傳多樣性，近交程度低。這對今后進行野豬種群保護和管理策略的制定有重要意義。而且，野豬作為東北虎的主要捕食對象，保持野豬種群較高的多樣性，對東北虎保護和管理也有積極意義。

冠心病是一種臨床多因素疾病,多因冠狀動脈粥樣硬化導致心血管疾病的發(fā)生。根據(jù)流行病學調(diào)查結(jié)果顯示,冠心病具有較高的發(fā)病率與死亡率,隨著人口老齡化的加劇,冠心病發(fā)病率呈逐漸增長趨勢[1]。對于冠心病高危人群進行早期診斷與早期干預對于冠心病的發(fā)生具有降低作用,可使患者的危害有效降低。本次研究對血清膽紅素與尿酸在冠心病患者的臨床檢測價值進行對比分析,現(xiàn)報告如下。

致謝:感謝國家林業(yè)局野生動物與自然保護區(qū)管理司“虎、東北豹資源調(diào)查技術研究”和“東北虎、東北豹種群及棲息地調(diào)查評估標準制定及信息匯總”項目的資助;感謝浙江大學方盛國教授給予實驗室分子生物學技術的咨詢和幫助;感謝國家林業(yè)局貓科動物研究中心對野外樣本與數(shù)據(jù)信息的提供。

［1］ 馬逸清．黑龍江省獸類志［M］．哈爾濱:黑龍江科學技術出版社，1986:390－395．

［2］ 周紹春，張明海，王雙玲．完達山林區(qū)森林采伐和非采伐區(qū)馬鹿、狍子對冬季生境因子選擇的比較［J］．動物學研究，2006，27(6):575－580．

［3］ Riordan P．Unsupervised recognition of individual tigers and snow leopards from their footprints［J］．Animal Conservation Forum，1998，1(4):253－262．

［4］ 蘭宏，王文，施立明．西南地區(qū)家豬和野豬mtDNA遺傳多樣性研究 ［J］．遺傳學報，1995，22(1):28－33．

［5］ Vernesi C，Crestanello B，Pecchioli E，et al．The genetic impact of demographic decline and reintroduction in the wild boar(Sur scrofa):a microsatellite analysis［J］．Molecular Ecology，2003，12(3):585－595．

［6］ 李崇奇．基于線粒體序列變異探討野豬系統(tǒng)地理學及家豬起源［D］．南京:南京師范大學，2005．

［7］ 張晨嶺．微衛(wèi)星變異探討中國大陸地區(qū)野豬遺傳多樣性、種群結(jié)構(gòu)和種群動態(tài)［D］．南京:南京師范大學，2006．

［8］ 霍金龍，苗永旺，霍海龍，等．云南南部地區(qū)野豬群體的遺傳多樣性 ［J］．動物學雜志，2008，43(6):137－146．

［9］ 韓春梅，高慶華，趙書紅，等．新疆野豬mtDNA控制區(qū)序列遺傳多樣性分析 ［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學，2008，36(8):3142－3143，3245．

［10］ Woodruff D S．Non-invasive genotyping of primates［J］．Primates，1993，34(3):333－346．

［11］ Walker J A，Hughes D A，Anders B A，et al．Quantitative intrashort interspersed elements PCR for species-specific DNA identification［J］．Analytical Biochemistry，2003，316(2):259－269．

［12］ Botstein D，White R L，Skolnick M，et al．Construction of a geneticlink age map in man using restriction fragment length polymorphisms［J］．American Journal of Human Genetics，1980，32(3):314－331．

［13］ Magurran A E．Biological diversity ［J］．Current Biology，2005，15(4):116－118．