蔡曉鋒，王小麗，徐晨曦，葛晨輝，王水，王全華

（上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心，植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心，200234）

菠菜（Spinacia oleraceaL.）屬于莧科藜亞科菠菜屬植物[1]，是世界上一種重要的經(jīng)濟蔬菜作物，是以綠葉為主要產(chǎn)品器官的一、二年生草本植物。菠菜起源于波斯地區(qū)（今伊朗及周邊），于公元647年傳入中國，被稱為波斯菜。由于其生長迅速并且耐低溫，可以越冬栽培，在世界上許多國家均有種植。根據(jù)聯(lián)合國世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2016年世界上菠菜產(chǎn)量約為2 668.4萬t（59個菠菜生產(chǎn)國數(shù)據(jù)），其中菠菜的生產(chǎn)主要集中在中國，約為2 448.5萬t，占世界總產(chǎn)量的91.8%；并且菠菜產(chǎn)量在中國蔬菜產(chǎn)量排名中位于第7位，占中國蔬菜總產(chǎn)量的4.21%，中國是世界上最大的菠菜種植國家及消費國家（http://www.fao.org/faostat/en/#data）。

菠菜是一種重要的深綠色葉用蔬菜，具有很高的營養(yǎng)價值，并逐漸被列入健康飲食菜單[2]。菠菜葉片含有豐富的β-胡蘿卜素、葉酸、葉黃素、維生素B、維生素K、維生素E和維生素C；同時富含鈣、磷、鈉和鉀等礦物質(zhì)元素；另外新鮮葉片中還含有豐富的抗氧化劑，是氧自由基吸收能力活性最高的蔬菜之一[3，4]。近幾年來，隨著生活水平的提高，人們對菠菜產(chǎn)品的消費量越來越大，同時對菠菜產(chǎn)品的營養(yǎng)和品質(zhì)也提出了更高的要求，另外在長期、大面積的生產(chǎn)過程中，菠菜病害也隨之發(fā)展，為害加重，尤其是霜霉病的大面積暴發(fā)，給種植者造成重大的損失，無法滿足市場供應(yīng)，因此選育營養(yǎng)豐富、抗病的優(yōu)良新品種是解決此問題的關(guān)鍵。而收集種質(zhì)資源、篩選鑒定菠菜抗病相關(guān)基因是進行菠菜抗病育種的前提和基礎(chǔ)。本文從菠菜種質(zhì)資源的收集、抗性遺傳與育種、分子標記及抗性機理等方面，綜述了菠菜抗病遺傳育種的研究進展，以期為菠菜抗病育種提供參考。

1 菠菜霜霉病及抗性種質(zhì)資源

菠菜生產(chǎn)中的主要病害是霜霉病和白銹病等，尤其以霜霉病最為嚴重。菠菜霜霉病是由專性病原體（Peronospora farinosaf.sp.spinaciae，Pfs）引起的氣傳病害[5]，主要為害植株葉片，苗期和成株期均可發(fā)生，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是菠菜上的毀滅性病害。

菠菜栽培歷史悠久、地域分布廣、種質(zhì)資源豐富，具有1個栽培種和2個野生型（S.turkestanica和S.tetrandra），國內(nèi)外的科研機構(gòu)對菠菜種質(zhì)資源進行了廣泛收集。據(jù)荷蘭遺傳資源中心Kik博士[6]報道，荷蘭遺傳種質(zhì)資源中心（CGN）保存菠菜種質(zhì)資源（包括野生種）387份，中國國家作物種質(zhì)庫保存菠菜種質(zhì)資源326份，美國農(nóng)業(yè)部（USDA）保存菠菜種質(zhì)資源301份，其他國家的科研機構(gòu)也保存著大量的菠菜種質(zhì)資源，共計1 938份。自20世紀50年代始，我國的蔬菜科研單位就開始了菠菜種質(zhì)資源的收集鑒定工作，目前已從我國27個省、市和其他3個國家共搜集入國家作物種質(zhì)庫保存的菠菜種質(zhì)資源333份[7]，豐富的菠菜種質(zhì)資源為后期進行菠菜抗病育種提供基礎(chǔ)。

2 菠菜霜霉病抗性遺傳及育種

盡管菠菜霜霉病抗性遺傳規(guī)律和抗性機制仍不明確，然而育種家們通過田間抗性鑒定，篩選抗性材料，培育出一系列的抗病品種。菠菜霜霉病菌首次報道是在1800年，但在1991年之前才鑒定出4個菠菜霜霉病菌生理小種[8]。在發(fā)現(xiàn)菠菜霜霉病生理小種3之前，一直認為菠菜霜霉病對生理小種1、2的抗性受1個顯性基因控制，而在發(fā)現(xiàn)該生理小種3后，發(fā)現(xiàn)菠菜霜霉病抗性基因受到2個連鎖的基因控制。國外的育種家針對這些生理小種篩選抗病資源，培育出抗病一代雜種，如Califlay、Dixie Market、Mazurka、Polka、Bolero 和 Bossanova 等[2]；而在接下來的20 a間則鑒定出10個霜霉病菌生理小種，并且發(fā)現(xiàn)部分新的生理小種對所有已知的遺傳抗性免疫[9，10]，育種家們針對這些新的生理小種尋找新的抗原，并培育出新的抗病品種，如El Dorado、El Palmar、Emilia、Lazio 和 Lombardia 等可以抗 1～10號生理小種。到目前為止，已經(jīng)分離鑒定出16個菠菜霜霉病生理小種[2，11，12]，為針對不同地區(qū)不同生理小種進行有目的的抗病育種工作奠定了基礎(chǔ)。

表1 菠菜霜霉病抗性位點、所抗生理小種及連鎖的遺傳標記

我國對菠菜霜霉病的研究則相對滯后，只有少量研究報道對我國存在的菠菜霜霉病菌生理小種進行分離鑒定，僅有范桂彥等[13]對5份采集于北京、山東、山西的霜霉病樣品進行菠菜霜霉病菌生理小種鑒定，尚未見其他關(guān)于菠菜霜霉病菌生理小種鑒定的報道[13]。目前仍主要通過田間鑒定法進行抗霜霉病菠菜品種選育如滬菠1號的選育[14]，和不同品種的比較試驗[15]等。在一些抗白銹病品種的推廣過程中，發(fā)現(xiàn)有些品種對霜霉病也表現(xiàn)田間抗性，但是具體的抗性遺傳機制還不清楚[2]。

我國菠菜生產(chǎn)中使用的抗霜霉病品種主要來自國外種子公司。這些國外抗病品種的大量推廣和單一使用，進一步造成霜霉病菌的擴散和快速進化，致使我國菠菜霜霉病菌生理小種急劇增加，常導致已經(jīng)大量推廣應(yīng)用的抗病品種不再抗病[16]。因此，培育抗病能力更強、適應(yīng)范圍更廣的菠菜新品種已成為目前抗病育種工作中急待解決的問題。

3 菠菜抗霜霉病分子標記及抗性機理研究

菠菜霜霉病抗性的鑒定主要是通過檢測病原菌的致病性，但是該方法耗時、耗力并且需要特定的環(huán)境條件進行病原菌的接種、篩選和鑒定，該過程控制不當極易引起霜霉病病原菌擴散。因此，篩選開發(fā)與霜霉病抗性位點或基因連鎖的分子標記，是更有效、更便捷的選育抗霜霉病新品種的方式。

Irish等[17]通過4次輪回回交，以抗病材料Lion和感病材料Viroflay為親本構(gòu)建菠菜霜霉病抗性（生理小種6）近等基因系（NIL1）。根據(jù)分離群體分析發(fā)現(xiàn)，該菠菜霜霉病抗性是由一個顯性基因控制，并將此抗性位點命名為Pfs-1。利用群體分離分析 （Bulk segregant analysis） 鑒 定 一 個 AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）標記與Pfs-1位點連鎖，用該連鎖位點開發(fā)了一個共顯性SCAR（Sequence Characterized Amplified Region）標記，這個SCAR標記與單顯性基因控制位點Pfs-1緊密連鎖（約1.7 cM），命名為Dm-1（表1）。通過對123個品種檢測，Dm-1標記可以正確區(qū)分120個品種的抗病表型；此外，包含Pfs-1位點的近等基因系抗多個霜霉病生理小種，說明Pfs-1位點可能包含抗性基因簇[9]。

前期霜霉病抗性鑒定結(jié)果認為，霜霉病抗性受6個位點的控制[9，17]。因為霜霉病生理小種命名時經(jīng)常采用Pfs或Pf縮寫，而第一個鑒定的霜霉病抗性位點也被命名為Pfs-1[17]，所以極容易造成混淆。為了便于區(qū)分將6個菠菜霜霉病抗性位點重新命名為 RPF1 ～RPF6 （Resistance againstPeronospora farinosa），RPF1即前期鑒定的Pfs-1位點，而其2個等位基因被分別命名為RPF1-1（顯性基因）和RPF1-2（隱性基因）[2]。含有RPF2抗性位點的菠菜可以抗1～10號生理小種，而11號生理小種可以克服菠菜品種對1～10號生理小種的抗性，但包含RPF1，RPF3和RPF6抗性位點的菠菜可以抗11號生理小種；生理小種12可以侵染含有RPF1和RPF2的菠菜品種，RPF3位點可以抗12號生理小種。13號生理小種可以克服RPF2和RPF3抗性位點對菠菜的保護，而包含RPF1位點的菠菜可以高效抵抗13號生理小種侵染。14號生理小種與12號生理小種相似，能夠引起相同的病態(tài)反應(yīng)，可以通過一些新的感病品種Pigeon、Cello和Celesta對它們加以區(qū)分[18]。

Feng等[19，20]利用新一代測序技術(shù)對菠菜霜霉病病原菌12、13、14號生理小種進行基因組測序，鑒定了1 000個左右簡單重復(fù)序列（SSR）和9 000個SNP位點，并根據(jù)霜霉病病原菌UA0510C的Pfs基因組測序結(jié)果，篩選出48對SSR引物，檢測了6、10、11、12、13、14 號生理小種；結(jié)果表明，48 對引物可以擴增出Pfs基因片段，其中4對引物還可以擴增其他同類的病原菌基因；另外有32對引物在Pfs基因擴增片段中具有多態(tài)性，并且部分引物鑒定出一些雜合位點，表明該位點屬于雜合抗性。Shi[21]利用 GBS（genotyping by sequencing）技術(shù)對 462 個菠菜基因型測序，獲得475 000 SNPs，通過關(guān)聯(lián)分析篩選出4個與菠菜霜霉病緊密連鎖的SNP標記。雖然抗霜霉病分子標記取得了一些進展，為培育抗病品種提供了分子依據(jù)，但相關(guān)抗性基因克隆還未見報道，菠菜抗霜霉病機理仍不明確。

4 菠菜抗性相關(guān)基因研究進展

盡管菠菜中6個與霜霉病抗性相關(guān)的位點尚未克隆或鑒定，但在擬南芥中霜霉病抗性機制的研究報道也有很多，可為研究菠菜霜霉病抗性機制提供良好的支持。到目前為止，已鑒定出28個不同的擬南芥霜霉病抗性基因（Recognition ofPeronospora parasitica，RPP）[22]，并且其中一些基因已被克隆和功能分析，如 RPP1、RPP5 和 RPP13[23～25]。 所有克隆的RPP基因均屬于植物抗性基因（Resistance，R）家族，NBS-LRR類亞家族 （Nucleotide binding siteleucine-rich repeats）。此外，許多RPP基因定位于MRCs（Major recognition gene complexes）基因位點上，如RPP5位點包含7個TIR-NBS-LRR類R基因，3個相關(guān)序列和2個非R基因[26]。而菠菜RPF1位點對多個霜霉病生理小種的抗性可能與RPP5位點相似，均含有多個抗性基因，對菠菜快速適應(yīng)和抵御多變的病原菌生理小種具有重要意義。

Bai等[27]在菠菜中克隆并鑒定了一個病程相關(guān)蛋白基因SoPR10；Feng等[28]通過對不含抗霜霉病位點、含有1個和2個霜霉病位點菠菜品種進行轉(zhuǎn)錄組測序，在菠菜品種Viroflay和Califlay之間發(fā)現(xiàn)上百個NBS-LRR抗病基因，同時也鑒定出一些病程相關(guān)蛋白基因如幾丁質(zhì)酶基因（Classes I to IV）。此外還發(fā)現(xiàn)1 800 SSRs，超過 6 000個SNPs，為分子標記開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。Xu等[29]通過對菠菜栽培種進行全基因組測序，在菠菜基因組中鑒定篩選出139個NBS-LRR基因，并且結(jié)合Irish等[17]對霜霉病生理小種6抗性基因定位結(jié)果，將標記Dm-1定位到第三條連鎖群上，在Dm-1標記附近發(fā)現(xiàn)5個NBS-LRR候選基因，其中2個NBS-LRR候選基因為串聯(lián)重復(fù)基因。折紅兵等[30]利用同源序列克隆的方法，從菠菜基因組中克隆到22個NBS-LRR類抗病基因[30]。這些研究為進一步克隆抗病基因及研究菠菜的抗病機理奠定堅實基礎(chǔ)。

5 菠菜抗性育種工作面臨的問題

盡管我國很早就開始了菠菜種質(zhì)資源的收集工作，但缺乏對資源系統(tǒng)的整理和鑒定，導致很多優(yōu)良的種質(zhì)資源在菠菜育種中無法被有效利用，尤其是在菠菜抗霜霉病的種質(zhì)資源的篩選、鑒定及利用方面與國外相比存在較大的差距。目前我國的菠菜抗病育種研究缺乏抗病種質(zhì)材料、抗病鑒定方法和先進的育種手段。因此，廣泛收集及整理國內(nèi)外的菠菜種質(zhì)資源，篩選針對不同地區(qū)的抗霜霉病菠菜種質(zhì)資源，加強分子生物學手段輔助育種及抗病機理研究，篩選抗病材料，從而培育出抗病品種，是解決菠菜病害的有效途徑。

6 展望

分子標記輔助選擇育種是將分子標記應(yīng)用于作物品種改良過程中進行選擇的一種輔助手段，可以減少連鎖累贅，獲得期望的個體，達到提高育種效率的目的，但在菠菜中該技術(shù)應(yīng)用的較少。當前針對分子技術(shù)的研究也僅局限在菠菜性型基因和抗霜霉病基因的定位上，已篩選到的分子標記多為AFLP標記，其應(yīng)用有很大的局限性，并且還不能應(yīng)用于準確鑒定菠菜的性型和抗性。目前隨著菠菜參考基因組測序和轉(zhuǎn)錄本測序的完成及高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建和完善，將會對開發(fā)分子標記，進行抗性基因精細定位和克隆提供支撐，同時也為分子標記輔助選擇育種奠定堅實的基礎(chǔ)，將大大促進菠菜抗性育種的研究進程。

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