董偉清 江文 何芳練 高美萍 韋紹龍 蔣慧萍 閉志強(qiáng) 顏梅新

芋[Colocasia esculenta （L.） Schott]屬天南星科芋屬，為多年生宿根草本植物，原產(chǎn)于中國。芋具有很高的營養(yǎng)價值，其球莖富含淀粉、維生素和氨基酸等營養(yǎng)成分，是世界各地廣為栽培的蔬菜和糧食作物，也是可選的生物能源作物，許多品種還具有藥用價值[1]。目前廣西已成為全國芋頭的主要產(chǎn)區(qū)之一，其中以荔浦地區(qū)種植的荔浦芋尤為出名，擁有超340 a的栽培歷史，已成為我國地理標(biāo)志產(chǎn)品。廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所選育的荔浦芋新品種桂芋2號，以其產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)、淀粉含量高、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)已成為廣西檳榔芋的主栽品種；但在栽培過程中常遭受芋疫病的為害，其品質(zhì)和產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響，給廣西芋頭產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開展桂芋2號芋疫病病原的研究，對桂芋2號生產(chǎn)和芋疫病防治具有重要意義。目前尚未見關(guān)于桂芋2號在不同生態(tài)栽培區(qū)芋疫霉的研究報(bào)道，本文以荔浦芋新品種桂芋2號在不同生態(tài)栽培區(qū)芋疫病標(biāo)樣為研究對象，采用形態(tài)觀察和分子生物學(xué)手段鑒定其疫霉種類，通過與辣椒疫霉配合明確其交配型類型，并測定病原對甲霜靈的敏感性，為芋疫病的綜合防治及抗病育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芋疫病樣本采集與病原菌分離

芋疫病樣本于2016年7～10月分別采集于南寧市、柳州市柳江區(qū)、桂林市荔浦縣青山鎮(zhèn)、賀州市賀街桂芋2號栽培區(qū)。病原菌分離采用常規(guī)組織分離法[2]。將具有芋疫病典型癥狀的病葉，從病健交接部位切取3 mm×4 mm大小的組織塊，經(jīng)表面消毒（75%酒精10 s，0.1%升汞1 min，無菌水沖洗2～3次）后移入 10%V8 培養(yǎng)基上[3]，25℃培養(yǎng) 4～5 d，待平板長出菌絲后，挑取菌落邊緣單菌絲的尖端移入不加抗生素的10%V8培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。將純化后的菌株放入20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的致病性測定

致病力測定參照周清平等[4]的方法，選取無病芋嫩葉置于室內(nèi)搪瓷盤中，搪瓷盤事先放2層紗布，加適量的滅菌水保濕，在葉片選4個點(diǎn)，其中3個點(diǎn)分別滴加20 μL的106個/mL孢子的孢子懸浮液，另一個點(diǎn)滴加20 μL滅菌水作對照。點(diǎn)樣后套上塑料薄膜蓋住搪瓷盤保濕，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后觀察發(fā)病情況。對接種發(fā)病的芋葉組織進(jìn)行病原菌再分離，觀察分離物是否與接種菌一致。

1.3 病原菌形態(tài)鑒定

病原菌形態(tài)鑒定參考李智軍等[5]方法，略有修改。將分離純化得到的菌株在10%V8培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d后，切取菌落邊緣的菌絲塊移至10%V8培養(yǎng)基中央，放置生化培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落形態(tài)，經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察病原菌形態(tài)特征并拍照。

1.4 芋疫霉菌菌株ITS序列分析

芋疫病菌總DNA提取采用SDS裂解法。采用真菌核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'） 和 ITS5 （5'-GGAAGTAAAAGT CGTAACAAGG-3'）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2 min，進(jìn)入循環(huán)，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相，PCR產(chǎn)物送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用 Blast（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進(jìn)行DNA序列分析。

1.5 芋疫霉的交配型鑒定

將分離獲得的芋疫霉菌株及辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株、A2交配型S-5菌株（由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)系劉西莉教授課題組惠贈）接種至10%V8培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d。用消毒牙簽挑取大小約4 mm×4 mm的各待測菌株菌塊接種至10%V8培養(yǎng)基平板上，各待測菌株分別與辣椒疫霉A1或A2交配型菌株進(jìn)行對峙培養(yǎng)[3,6]，兩菌絲塊相距30～40 mm，每處理設(shè)3皿重復(fù)，分別設(shè)芋疫霉菌株單株自身配對，辣椒疫霉A1和A2交配型菌株對峙培養(yǎng)及A1、A2菌株單株自身配對為對照。置于28℃下黑暗培養(yǎng)7 d，通過光學(xué)顯微鏡觀察是否產(chǎn)生卵孢子并拍照，從而鑒定芋疫霉菌株交配型類型。

1.6 芋疫霉對甲霜靈的敏感性測定

芋疫霉對甲霜靈的敏感性測定參考Goodwin等[7]的方法，略有修改。在10%V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的疫霉菌株菌落邊緣切取直徑約5 mm的菌塊，分別接種至含甲霜靈0、5、100 mg/L的培養(yǎng)基平板中央，置28℃培養(yǎng)7 d，測量其菌落大小，每處理設(shè)3個重復(fù)?？剐詼y定標(biāo)準(zhǔn)參考Misra等[8]，甲霜靈濃度為5、100 mg/L的平板上菌落生長量均≥40%對照（甲霜靈濃度0 mg/L）生長量為抗性；兩者均≤40%對照生長量為敏感；甲霜靈濃度為5 mg/L平板上菌落生長量≥40%對照生長量≥甲霜靈濃度為100 mg/L平板上菌落生長量，為中度抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

芋疫病主要為害葉片，也侵染葉柄。芋葉片上初生病斑為黃褐色圓形斑點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大融合形成圓形或不規(guī)則形的大斑，病斑具有明顯的褐色同心輪紋，邊緣具水漬狀暗綠色或黃色暈圈。潮濕時病斑表面生灰白色霉層，并具有黃色至淡褐色膠質(zhì)分泌物（圖 1）。

2.2 芋疫病病原菌的形態(tài)特征

從表現(xiàn)明顯癥狀的芋葉組織分離純化獲得8個菌株，在10%V8培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，8個菌株菌落基本一致。菌落圓形，邊緣整齊，整體呈淺黃至黃白色，氣生菌絲較少，無隔，無色透明，寬 3.80～6.84 μm。孢子囊卵形、長卵形、橢圓形，基部圓形，頂部有一乳頭狀突起（圖 2A、2B、2C）。 游動孢子（圖 2D）在孢子囊內(nèi)產(chǎn)生，圓球形，通過排孢孔擠出，并迅速游動，每個孢子囊可以產(chǎn)生數(shù)個游動孢子。根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參照鄭小波[6]、陸家云[9]對疫霉的描述，初步將該病原菌鑒定為芋疫霉Phytophthora colocasiae。經(jīng)致病性試驗(yàn)，8個芋疫霉菌株致病力相當(dāng)，所引起的癥狀與原癥狀相似，從接種組織中分離獲得的病原菌與原接種菌形態(tài)一致。

2.3 芋疫病菌分子生物學(xué)鑒定

以待測的8個芋疫霉菌株的總DNA為模板，采用ITS4和ITS5引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有測試菌株均獲得大小約為890 bp的產(chǎn)物。測序結(jié)果表明，所測序列與GenBank發(fā)表的Phytophthoracolocasiae不同分離物序列同源性達(dá)99%，進(jìn)一步確定所測菌株均為芋疫霉（P.colocasiae）。

圖1 芋疫病癥狀

2.4 芋疫霉交配型的鑒定

芋疫霉待測菌株分別與辣椒疫霉A1、A2交配型菌株對峙培養(yǎng)7 d后（圖 2E），利用消毒牙簽挑取兩菌交界處的菌絲放在玻片上置于顯微鏡下觀察卵孢子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有待測的8個芋疫霉菌株和辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株的對峙培養(yǎng)均可觀察到卵孢子的產(chǎn)生（圖2F），說明待測的8個芋疫霉菌株均屬于A2交配型，對照辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株和A2交配型S-5菌株對峙培養(yǎng)可觀察到卵孢子（圖2G），而待測8個芋疫霉菌株與A2交配型S-5菌株對峙培養(yǎng)，8個芋疫霉菌株、辣椒疫霉A1交配型HD-3菌株及A2交配型S-5菌株單獨(dú)培養(yǎng)均未發(fā)現(xiàn)卵孢子，說明8個芋疫霉菌株不屬于A1交配型或其他交配型。

2.5 芋疫霉對甲霜靈的敏感性

8個芋疫霉菌株在甲霜靈0 mg/L濃度處理下，28℃培養(yǎng)7 d后菌落長滿整個培養(yǎng)皿，而在甲霜靈5 mg/L和100 mg/L濃度處理下，8個芋疫霉菌株菌落直徑大小均為0 mm。

圖2 芋疫霉形態(tài)特征

3 討論

傳統(tǒng)的疫霉鑒定主要根據(jù)菌落、有性器官、孢子囊、孢囊梗等形態(tài)特征進(jìn)行[10]。由于疫霉菌形態(tài)特征會因培養(yǎng)條件不同而存在差異，加之自身形態(tài)具有較大的變異性，給疫霉的分類鑒定帶來一定難度。隨著分子生物學(xué)鑒定手段運(yùn)用于疫霉的分類鑒定中，許多報(bào)道已經(jīng)證實(shí)疫霉菌5.8S rDNA ITS區(qū)域是一段穩(wěn)定、保守而又具有種間特異性的基因區(qū)域，可以通過該區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物對疫霉進(jìn)行分子鑒定[10～12]。陸葉等[3]對來源于我國廣西桂東南地區(qū)的疫病霉株ITS序列進(jìn)行分析，所測序列與GenBank發(fā)表的P.colocasiae不同分離物序列同源性高達(dá)97%～100%。而本研究結(jié)合形態(tài)特征和分子生物學(xué)手段對不同生態(tài)栽培區(qū)的桂芋2號芋疫霉菌菌株進(jìn)行了鑒定，所測ITS序列與NBCI上公布的芋疫霉菌分離物同源性達(dá)99%。

芋疫病病原早于1890年在印度尼西亞被鑒定為Phytophthora colocasiae[13]，該菌屬于疫霉屬（Phytophthora），有性生殖營卵配生殖，屬異宗配合，一般需要兩種不同交配型菌株進(jìn)行有性生殖產(chǎn)生卵孢子，而卵孢子是疫霉菌度過不良環(huán)境及越冬的主要菌態(tài)[3]。Ko[14]對來自夏威夷101個芋疫霉菌株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些芋疫霉菌株均為A1交配型，而另外來自亞洲的5個芋疫霉菌株則鑒定為A2交配型。Ann等[15]對采集自中國臺灣的799個芋疫霉分離物進(jìn)行交配型鑒定，發(fā)現(xiàn)所有測試菌株均為A2交配型，作者認(rèn)為臺灣不是芋疫霉菌的起源地。而Lin等[16]對臺灣芋疫霉菌研究發(fā)現(xiàn)絕大部分菌株屬于A2交配型，另外，在某些地方還發(fā)現(xiàn)了A1A2交配型菌株，并通過無性培養(yǎng)獲得了A1交配型菌株，作者認(rèn)為臺灣芋疫霉在某些地方存在遺傳多樣性的可能。Zhang等[17]對我國海南芋疫霉菌進(jìn)行研究，結(jié)果表明海南芋疫霉存在著豐富遺傳多樣性，280個芋疫霉菌株中A1交配型菌株有136個,102個菌株為A2，而42個菌株為A0交配型，據(jù)此作者認(rèn)為我國海南為世界芋疫霉的起源中心。據(jù)報(bào)道，印度北部芋疫霉也存在豐富的多樣性，到目前為止發(fā)現(xiàn) A1交配型和 A2交配型同時存在[8，18，19]。陸葉等[3]對廣西桂東南地區(qū)的芋疫霉菌株進(jìn)行交配型測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有芋疫霉菌株均屬于A2交配型。本研究分離獲得的8個芋疫霉菌株交配型均為A2交配型，與陸葉等研究結(jié)果相似。因此推斷，這些地區(qū)桂芋2號芋頭產(chǎn)區(qū)田間芋疫霉發(fā)生有性生殖的可能性非常低。

化學(xué)防治是防治疫病的重要措施之一，而甲霜靈是防治疫病比較有效的藥劑之一，但在20世紀(jì)90年代開始陸續(xù)報(bào)道一些疫霉對該藥劑產(chǎn)生了抗藥性，如Phytophthora parasitica[20]，Phytophthora infestans[21]。對于芋疫霉抗藥性，Misra等[8]報(bào)道在印度分離到一株芋疫霉98-111對甲霜靈產(chǎn)生了抗藥性，說明芋疫霉已經(jīng)開始對甲霜靈產(chǎn)生了抗藥性。而本研究的芋疫霉菌對甲霜靈非常敏感，在5 mg/L濃度下生長受到抑制。

4 結(jié)論

芋疫病主要以帶菌球莖為初侵染源，發(fā)病部位上產(chǎn)生的孢子囊和游動孢子通過氣流和雨水擊濺傳播，成為病害發(fā)生與流行的主要因素。對于4個桂芋2號栽培區(qū)的疫病采用因地制宜的防治措施，建議與玉米、水稻、姜等作物輪作、間作，同時注意避免與茄科、葫蘆科、豆科等辣椒疫霉的寄主輪作、間種。種植脫毒健康種苗，減少病害的發(fā)生。此外，甲霜靈仍可作為化學(xué)防治的主要藥劑，建議與其他藥劑交替使用。

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