姚婷婷 蒲小龍 葉露瑩 宋敏娜 李小婷 葉如夢 寧俊楠 郭志雄 佘文琴 潘東明

摘 要 以3年生中國水仙品種‘金盞銀臺主芽為試驗材料，經(jīng)5和35℃變溫貯藏水仙球，通過石蠟切片形態(tài)解剖學觀察主芽活力，利用qRT-PCR方法分析水仙主芽在貯藏時期ABA和GA相關基因表達變化。結果表明，水仙主芽生長點的細胞排列緊密，35℃高溫貯藏有利于水仙主芽的生長發(fā)育。qRT-PCR分析表明，貯藏期間ABA合成和代謝相關基因呈現(xiàn)不規(guī)則變化趨勢，變溫貯藏對NtABA2基因影響顯著；GA相關基因整體呈下降趨勢，變溫貯藏對NtGA20X基因影響顯著。

關鍵詞 變溫 ；貯藏 ；水仙 ；芽

中圖分類號 S682.2+1 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.010

Abstract Bulbs of Narcissus variety Jinzhanyintai at the age of 3 years old were stored at the changing temperatures of 5 C and 35 C and was embedded in paraffin and cut into sections for morphological and anatomical observation of the vigor of their main buds. The change of the ABA and GA - related gene expression of the main buds of the bulbs during the storage was analyzed by using the qRT-PCR. The results showed that the cells of the main buds of Narcissus bulbs in the growth points were closely arranged， and their storage at the high temperature of 35 C was beneficial to the growth of Narcissus main buds. The qRT-PCR analysis showed that the genes related to ABA synthesis and metabolism tended to change irregularly， and that the storage at the changing temperature had significant effect on NtABA2 gene. The GA-related genes tended to decrease in general， and the storage at the changing temperature had significant effect on NtGA20X gene.

Keywords changing temperature ； storage ； Narcissus ； bud

中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）屬石蒜科水仙屬多年生草本植物，具有很高的觀賞價值，是中國十大名花之一，在春節(jié)開花，受到很多人的喜愛。中國水仙因夏季高溫無法繼續(xù)生長而以鱗莖芽的形式進入休眠，溫度是影響水仙休眠的重要因素之一[1]，溫度也是影響植物休眠解除重要的環(huán)境因素[2-3]。

溫度不同對植物休眠解除結果也不同，高溫（高于70℃）能夠打破豆科種子物理休眠[4-5]，高溫也可打破有些植物休眠。孫紅梅等[6]發(fā)現(xiàn)，利用變溫處理方式可解除百合鱗莖休眠；高東升等[7]和熊國勝等[8]發(fā)現(xiàn)，5℃是打破休眠的最佳溫度，但是也有些植物是在0℃以下打破休眠，而某些植物在低于0℃的環(huán)境下反而促進休眠，夜晚-13～-4℃的溫度可促進美國山核桃的芽萌發(fā)[9]。

脫落酸（ABA）和赤霉素（GA）是影響植物生長的重要激素，其中ABA 是調控種子休眠和萌發(fā)重要的植物激素；赤霉素是廣泛存在的一類植物激素，其功能是促進營養(yǎng)生長和打破休眠等。ABA合成和降解受到很多基因的調控，其中NtCYP和NtNCED是其合成的重要基因[10]，NtNCED 是其合成的關鍵酶，也是 ABA 整個生物合成過程中的關鍵調控酶[11]。赤霉素（GA）能夠解除植物休眠，促進種子萌發(fā)，對植物生長起著重要的作用。

目前關于水仙休眠的研究很少與ABA和GA相關基因聯(lián)系起來，尚未見類似的報道。本研究以水仙主芽為材料，測定變溫貯藏對中國水仙主芽形態(tài)學和基因表達含量變化的影響，對進一步研究變溫貯藏的水仙休眠機制具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為中國水仙‘金盞銀臺3年生的水仙球，來自福建省漳州市商業(yè)種植基地。試驗處理：貯藏1組，將3年生中國水仙球置于5℃貯藏45 d后放到35℃中；貯藏2組，于5℃貯藏75 d放后放到到35℃中。2016年8月3日開始采樣，第2次取樣周期間隔30 d，之后每隔15 d取樣一次，共取樣5次。選取水仙球的主芽作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制作材料處理和固定

用解剖刀取出主芽，立刻放到固定液FAA（5 mL甲醛+5 mL冰醋酸+90 mL70%乙醇）中，固定好后備用。

脫水。將固定后的材料，依次經(jīng)過70%、85%、95%、100%乙醇脫水，每次2 h。

透明。用無水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）過渡2 h，二甲苯透明2次，每次1 h。

浸蠟。逐步往二甲苯中加入石蠟碎屑，二者體積比約為1∶1，放入37℃恒溫箱內(nèi)過夜，次日用含有石蠟和二甲苯（V∶V=3∶1）的溶液于58℃浸泡2 h，之后用純石蠟于65℃浸泡1 h，連續(xù)換5次純石蠟溶液，每次1 h。

包埋。提前打開包埋機和冷凍機，備好紙盒，將主芽放入紙盒內(nèi)，用鑷子固定好位置。

修蠟塊和切片。根據(jù)所切的位置修整蠟塊，將修好的蠟塊粘在包埋盒上并做好標記；提前打開烘片機和展片機，將包埋盒置于自動切片機上，切片厚度約為10～12 μm，切片的過程中不斷觀察，直至切到所需的位置；將蠟條展開，用粘附性載玻片將蠟條平整地撈起，在烘片機上烘干。

細胞核染色。參照丁安琪[1]的方法，略作修改。將石蠟切片放入純二甲苯中20 min，重復1次，轉入無水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）溶液中5 min；分別用100%、95%、85%、70%、50%、30%乙醇浸泡5 min，接著分別置于蒸餾水中5 min，后置于蘇木精染色液中30 min；染色后用自來水沖洗12 min，之后分別用30%、50%、70%、85%、95%、100%乙醇脫水，各3 min；脫水后置于無水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）溶液中3 min ，用純二甲苯透明5 min，最后用中性樹脂封片。

觀察。用LEICA（DMi8）顯微鏡對主芽活力變化進行觀察和拍照。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成

中國水仙總RNA提取參照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DNA-free）說明書提取。cDNA合成采用TAKARA公司的PrimeScript RT reagent Kit，具體步驟參照試劑盒說明書。

1.2.3 熒光定量PCR引物設計

內(nèi)參基因和目的基因熒光定量引物均采用本實驗室蒲小龍[12]實驗設計中的引物（表1），選用actin基因為內(nèi)參基因。

1.2.4 定量PCR反應體系及程序

參照TAKARA公司SYBR Premix Ex-TaqTM（Tli RNaseH Plus）說明書，在定量PCR儀中進行，PCR反應體系見表2。

2 結果與分析

2.1 水仙主芽活力分析

采用蘇木精對中國水仙主芽進行染色，觀察主芽生長點形態(tài)的改變和細胞核活力狀況。結果顯示，水仙主芽生長點往上呈三角形生長同時分化鱗片。貯藏2組主芽生長的速度較貯藏1組快，其生長點分化出的鱗莖變長且排列較稀疏。貯藏75 d后，貯藏1組水仙主芽生長點呈山峰狀快速生長分化（圖1-B1）；貯藏120 d后水仙主芽生長錐的染色程度深，細胞小而且與鱗片之間排列緊密（圖1-E1）。貯藏1組主芽生長點染色程度比貯藏2組深，貯藏2組細胞排列稀疏而且生長點細胞大。于5℃貯藏45 d和75 d后水仙主芽生長點發(fā)育緩慢（圖1-A1、1-B2），于35℃貯藏時水仙主芽生長點形態(tài)發(fā)育較快（圖1- B2、1-C1、1-D1、1-E1）。

2.2 中國水仙主芽ABA和GA相關基因的相對表達量變化

對中國水仙球變溫貯藏期間ABA和GA相關基因進行熒光定量分析，結果如圖2所示，除了NtZEP和NtNCED外，其余基因均差異顯著。

中國水仙主芽貯藏1組：ABA合成相關基因NtZEP和NtABA2表達量呈下降趨勢，但NtABA2表達量貯藏75 d后明顯下降且保持在較低的水平；NtNCED和NtAAO3表達量呈 “上升-下降”的變化趨勢，貯藏75 d時基因表達量高于其它時期，貯藏75 d后呈下降趨勢；ABA降解相關基因NtCYP表達量呈“下降-上升”的變化趨勢。中國水仙主芽貯藏2組：ABA合成相關基因NtNCED和NtZEP表達量呈“下降-上升”的變化趨勢，NtAAO3表達量呈“上升-下降”趨勢，NtABA2表達量貯藏90 d后明顯下降，隨后保持在較低的水平；ABA降解相關基因NtCYP表達量呈下降趨勢。貯藏1組NtCYP基因表達量在貯藏45 d時出現(xiàn)最大值，貯藏2組則在75 d時出現(xiàn)最大值，二者都是在5℃貯藏時出現(xiàn)最大值。

貯藏1組GA相關基因NtGA3OX表達量呈“上升-下降”的變化趨勢，貯藏2組NtGA3OX呈上升趨勢；貯藏1組NtGA2OX表達量呈“上升-下降-上升”的變化趨勢，貯藏2組NtGA2OX表達量整體呈下降趨勢；貯藏1組和2組NtGA20X表達量整體呈下降趨勢，貯藏1組在貯藏45 d時出現(xiàn)最大值，貯藏2組在貯藏75 d時出現(xiàn)最大值，二者都是在5℃貯藏時表達水平高，35℃貯藏時表達水平低。

3 討論

通過對中國水仙主芽進行形態(tài)學觀察可知，高溫貯藏有利于水仙主芽形態(tài)發(fā)育，低溫抑制水仙主芽形態(tài)發(fā)育。5和35℃貯藏時水仙主芽生長點均分化鱗片，5℃貯藏45 d（1-A1）、75d（1-B2）主芽生長點均有活力，貯藏75 d時（1-B2）的活力高些，可能是由于隨著5℃貯藏時間的延長，因貯藏溫度過低導致生長代謝緩慢，能夠在較長時間內(nèi)維持主芽活力，故生長緩慢。于35℃中貯藏時，貯藏2組發(fā)育速度高于貯藏1組，表明高溫能夠促進水仙主芽形態(tài)發(fā)育。林小蘋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，儲藏在高溫條件下的水仙花球成花率明顯高于低溫條件下，可見高溫對花芽分化有利，低溫顯著降低成花率。鐘衡[14]研究表明，中國水仙主芽花芽在7月份上旬開始分化，8月份花芽分化形成花被，9月形成雌蕊和副花冠。郭蕊等[15]研究表明，東方百合雜種系的西伯利于3～5℃貯藏45 d后休眠解除，花芽開始分化；亞洲百合雜種系歌德琳娜于3～5℃貯藏30 d左右休眠被打破，種植1周后花芽分化。上述研究與本研究結論（5℃貯藏打破休眠）一致，但是5℃貯藏的中國水仙尚未完成花芽分化。

對ABA和GA相關基因表達水平進行分析可知，ABA合成途徑中的相關基因表達水平并不一致，NtABA2于35℃中貯藏后，基因表達量很低，表明高溫貯藏抑制了NtABA2基因表達，這與水仙遇高溫進入休眠的結論基本一致，NtABA2基因在ABA合成過程中起著關鍵的作用。貯藏1組和貯藏2組NtZEP基因表達并無明顯差異，在35℃貯藏時表達量均上升，2組表達水平基本一致，表明該基因維持35℃貯藏時水仙芽內(nèi)部的ABA水平。貯藏1組NtNCED和NtAAO3呈先上升后下降的變化趨勢，上升是因為該基因對35℃貯藏的脅迫反應，下降是由于隨著貯藏時間的延長，35℃誘導NtNCED和NtAAO3表達量低。NtCYP基因表達呈下降趨勢，于35℃貯藏后該基因表達量降低，是由于高溫降低了ABA的降解水平。

對GA代謝相關基因相對表達量進行分析可知，NtGA3OX和NtGA2OX基因相對表達量較高。赤霉素合成相關基因NtGA3OX在35℃貯藏后，貯藏1組表達量先上升后下降，是由于水仙休眠被打破，赤霉素在這個階段起著重要作用；貯藏2組表達量水平呈上升趨勢，是因為該基因的表達受限于貯藏時間。貯藏1組NtGA2OX基因表達量先上升后下降隨后又上升，貯藏2組整體呈現(xiàn)下降趨勢，表明該基因表達量受35℃貯藏溫度的影響。在35℃貯藏后NtGA2OX基因表達水平整體比較低，表明該基因表達受到35℃貯藏的抑制。

綜上所述，變溫貯藏只能夠打破水仙休眠而無法完成花芽分化，正常水仙在種植50 d后開花，但是變溫貯藏只能長出葉片，無法開花。從形態(tài)學觀察得知，水仙主芽形態(tài)依舊是葉芽分化的狀態(tài)。變溫貯藏對ABA和GA相關基因表達水平有很大的影響，其中NtABA2、NtCYP和NtGA20X受35℃貯藏的影響比較大。

參考文獻

[1] 丁安琪. 溫度對中國水仙休眠進程相關生理和基因表達的影響[D]. 福州：福建農(nóng)林大學，2016

[2] Hu X W， Wang Y R， Wu Y P， et al. Role of the lens in physical dormancy in seeds of Sophora alopecuroides L.（Fabaceae） from north-west China[J]. Australian Journal of Agricultural Research， 2008， 59（6）： 491-497.

[3] Rutar R， Stjepanovic M， Popovic S， et al. Effect of temperature on germination and hard alfalfa seed[J]. Ciheam， 2001， 2： 137-139.

[4] Mckeon G M， Mott J J. The effect of temperature on the field softening of hard seed of Stylosanthes humilis and S. hamata in a dry monsoonal climate[J]. Australian Journal of Agricultural Research， 1982， 33（1）： 75-85.

[5] Ribeiro L C， Pedrosa M， Borghetti F.Heat shock effects on seed germination of five Brazilian savanna species[J]. Plant Biology， 2013， 15（1）： 152 -157.

[6] 孫紅梅，李天來，李云飛，等. 百合鱗莖低溫處理效應初報[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2003，34 （3）：169-172.

[7] 高東升，束懷瑞， 李憲利， 等. 桃自然休眠過程中外源激素對花芽碳水化合物的調控效應[J]. 果樹學報，2002，19（2）：104-107.

[8] 熊國勝，李家洋，王永紅.植物激素調控研究進展[J].中國科學，2009，54（18）：2 718-2 733 .

[9] Santner A， Calderonvillalobos L I A， Estelle M. Plant hormones are versatile chemical regulators of plant growth[J]. Nat Chem Biol， 2009， 5（5）： 301-307.

[10] 葛蘇潔，李淑娟. ABA在種子發(fā)育·休眠和萌發(fā)過程中的生理調控[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（18）：10 727-10 730，10 732

[11] 胡鵬偉，黃桃鵬，李媚娟，等. 脫落酸的生物合成和信號調控進展[J]. 生命科學，2015，27（9）：1 193-1 196

[12] 蒲小龍. 中國水仙休眠相關形態(tài)、生理及轉錄組分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學，2017

[13] 林小蘋，張凌霞. 不同貯藏溫度對水仙花球生長發(fā)育的影響[J]. 福建熱作科技，2008，33（2）：5-7.

[14] 鐘 衡. 中國水仙花芽分化的研究[J]. 園藝學報，1984，11（3）：195-200.

[15] 郭 蕊，趙祥云，王文和，等. 百合花芽分化的形態(tài)學觀察[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2006，37（1）： 31-34.