朱城波，吳小妹，馮麗霞，黃象鵬，龐林江，楊虎清，方正偉，王穎，賴姝毓，張宜明,2*

1. 浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 宜賓學(xué)院博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，四川 宜賓 644000

游離氨基酸通過多種途徑參與茶葉色、香、味的形成，進(jìn)而影響品質(zhì)[1-3]，茶氨酸是茶葉鮮味與鮮香的主要呈味物質(zhì)[4-6]，屬非蛋白質(zhì)態(tài)可溶性氨基酸，占茶葉干重 1%~2%[7-10]。茶氨酸最早被日本學(xué)者 Sakato從日本綠茶中發(fā)現(xiàn)，具有焦糖香和鮮爽味，能緩解茶葉的苦澀味[11]。有研究顯示茶氨酸與綠茶滋味的相關(guān)系數(shù)高達(dá) 0.787~0.876[12]。目前檢測茶氨酸的方法主要依賴高效液相色譜法（HPLC）和毛細(xì)管電泳測定法[13-14]，需要繁瑣的前處理與衍生過程（柱前或柱后），且設(shè)備購置與維護(hù)成本高昂。隨著茶氨酸在膳食補(bǔ)充劑、保健食品等領(lǐng)域被廣泛開發(fā)應(yīng)用，得到一種能夠快速直讀檢測茶氨酸的方法顯得十分必要。

近年來，農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與安全的快速檢測與分析成為研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)，常見的主要手段有快速顯色、金標(biāo)試紙條、農(nóng)殘檢測酶抑制紙片法以及層析法等[15-18]。利用紙層析或者薄層層析可以實(shí)現(xiàn)對茶葉中氨基酸的快速、半定量分析[15,19]。盡管與紙層析原理類似，但一般認(rèn)為薄層層析擁有更好的分離效能。為得到相應(yīng)的顯色信號，傳統(tǒng)薄層色譜顯色是以顯色劑在薄層板上噴霧而成，但這種手工操作的顯色方式有著顯而易見缺點(diǎn)包括無法實(shí)現(xiàn)快速自顯色、重現(xiàn)性差、定量不準(zhǔn)確等問題。進(jìn)一步，研究人員將一定量的顯色劑如茚三酮溶解于展開劑中，其顯色效果較噴霧法有所改善[15,20-21]。盡管如此，由于氨基酸性質(zhì)各異，可能導(dǎo)致顯色混雜并影響比移值Rf值的測定。更為重要的是，無論噴霧還是將顯色劑混合在展開劑中都將導(dǎo)致薄層層析條帶非顯色區(qū)的本底顏色加深，減弱了顯色的信噪比，不利于裸眼直讀以及儀器判讀。

本研究首先利用溶膠-凝膠反應(yīng)制備了自顯色活性的納米顯色劑，通過多種表征手段證實(shí)茚三酮可以穩(wěn)定固定在納米二氧化鈦材料中。將該納米材料分散液作為一種納米顯色劑打印在高效薄層條帶上從而構(gòu)筑成直讀顯色條帶。用沸水浸提綠茶茶樣，經(jīng)薄層層析及其表面固定的納米顯色劑顯色可直接用于茶湯中茶氨酸的定性及半定量判別，同時(shí)利用高效液相方法驗(yàn)證本研究的快速直讀檢測策略。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天目云霧茶（2016年春），產(chǎn)于杭州臨安市太湖源東坑村頂谷云霧茶業(yè)有限公司。甲醇（優(yōu)級純，天津市四有精細(xì)化學(xué)品有限公司）；L-茶氨酸（純度大于99%，上海源葉生物科技有限公司）；異丙醇（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；茚三酮（純度大于99%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙酸乙酯；無水乙醇（分析純，安徽安特食品股份有限公司）；甲苯（分析純，杭州雙林化工試劑廠）；鈦酸四丁酯（純度大于99%，北京百靈威科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用普通定量濾紙。

以甲苯和乙醇按照體積比 1︰1配制混合溶劑，以此配制0.1 mol·L-1的鈦酸四丁酯前驅(qū)體溶液。2.5%茚三酮水解溶液：用分析天平稱取2.5 g茚三酮粉末，將其溶于50 mL無水乙醇溶液中，待徹底溶解后加入50 mL蒸餾水，均勻混合。

配制樣品稀釋液為異丙醇和水混合液（V︰V=1︰1）。茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取50 mg茶氨酸粉末標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液溶解定容至 100 mL，此溶液中每1 mL中含有0.5 mg茶氨酸，依次配制濃度為 0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 mg·mL-1的茶氨酸溶液。噴霧顯色劑：噴霧顯色劑（2%茚三酮）：取2 g茚三酮粉末溶于50 mL乙醇加水定容至 100 mL，用噴壺裝好置于暗處保存。薄層展開劑為 V75%乙醇︰V冰乙酸=10︰1。

1.2 儀器與設(shè)備

點(diǎn)樣毛細(xì)管；SP-Ⅱ電動點(diǎn)樣機(jī)（上?？普軆x器設(shè)備公司）；展開缸（10 cm×20 cm）；硅膠G60薄層層析板（德國默克）；真空抽濾裝置；分析天平；均質(zhì)器（IKA，美國）；恒溫水浴鍋。日立L-8900全自動氨基酸分析儀及相關(guān)色譜柱。

1.3 納米顯色劑制備與表征

濾膜材質(zhì)為普通定量濾紙，將濾膜剪成圓形尺寸與抽濾裝置上的砂芯漏斗相適應(yīng)。利用抽濾裝置將前驅(qū)體溶液流入濾膜，使濾膜表面充分吸附前驅(qū)體，以無水乙醇充分洗滌后加入2.5%的茚三酮溶液，水解反應(yīng)3 min后再次乙醇沖洗并將濾紙抽濾干燥。該溶膠-凝膠的方法首先在濾紙表面吸附鈦酸四丁酯，后續(xù)水解形成納米二氧化鈦過程中，茚三酮分子被交聯(lián)固定和吸附包裹的方式進(jìn)入濾紙纖維素表面的納米結(jié)構(gòu)中，完成了相應(yīng)的沉積/水解一個(gè)循環(huán)。通過重復(fù)以上吸附、洗滌、水解、再洗滌與干燥過程最終形成茚三酮/納米二氧化鈦復(fù)合物。將合成包覆有茚三酮/納米二氧化鈦復(fù)合物的濾膜經(jīng)乙醇浸泡，以均質(zhì)器均質(zhì)可以得到分散均勻的淡乳白色的茚三酮/納米二氧化鈦復(fù)合物，具體合成路線見圖1及前期專利（發(fā)明專利ZL 201510817477.3）[22]。

精確移取制備好的納米顯色劑乙醇分散液（10 mg·mL-1）10 μL 于透射電鏡銅網(wǎng)上，待室溫自然揮發(fā)至干燥，以透射電鏡觀察濾紙纖維表面形成的納米顯色劑形貌。再另取1 mL左右該分散液，室溫?fù)]發(fā)至干燥得10 mg納米顯色劑，經(jīng)溴化鉀壓片等過程供紅外光譜表征。

1.4 茶湯制備與提取

茶葉磨碎過 1 mm篩網(wǎng)，準(zhǔn)確稱取(3.00±0.01)g磨碎茶樣于 500 mL錐形瓶中，加入沸水450 mL，在沸水浴中浸提45 min（每隔10 min搖瓶1次），趁熱過濾，冷卻后定容至500 mL得供試液[15]。研究表明熱浸提同冷浸提相比浸提更為完全，氨基酸總量相差 3倍左右[23]。

圖1 茚三酮/納米二氧化鈦的合成路線Fig. 1 The construction scheme of ninhydrin/nano-titanium dioxide nanomaterials

脫色：乙酸乙酯脫色。將浸提茶湯和乙酸乙酯按照 2︰1的比例進(jìn)行混合均勻，振蕩脫色。充分振蕩5 min，靜置1 h，棄上層酯層，下清水溶液冷藏保存。同原茶湯對比色澤明顯偏淡，且脫色后茶湯利于長期保存。

1.5 直讀顯色條帶制備

1.5.1 薄層板的預(yù)處理

薄層板除雜、活化：將鋁基板裁成4 cm×7 cm，鋁基板長邊距上下沿1 cm處分別左右標(biāo)記，取95%甲醇5 mL于展開缸中做展開劑，薄層板展開結(jié)束，60℃烘干，裁去上沿 1 cm含有雜質(zhì)部分，得到標(biāo)準(zhǔn)的4 cm×6 cm鋁基板于干燥器中密封保存。

1.5.2 納米顯色直讀薄層板

進(jìn)樣針吸取 15 μL納米顯色劑分散液（10 mg·mL-1）打印在茶氨酸對應(yīng)Rf值水平線上，打印寬度為2 mm，60℃干燥后放入干燥器備用。

1.6 點(diǎn)樣、展開與顯色

點(diǎn)樣：在薄層板距下沿 1.0 cm水平處均勻標(biāo)記點(diǎn)樣起始點(diǎn)，鋁基薄層板置于點(diǎn)樣機(jī)60℃加熱盤上準(zhǔn)確將 2 μL樣品全量點(diǎn)樣。用毛細(xì)點(diǎn)樣管沾取樣品輕點(diǎn)在薄層板標(biāo)記點(diǎn)上，點(diǎn)狀點(diǎn)樣，控制點(diǎn)樣大小直徑不超過2 mm，干燥后備用。

薄層層析：取4 mL展開劑于展開缸中，用鑷子將薄層板點(diǎn)樣端浸入展開缸中，要求展開劑液面低于點(diǎn)樣線，展開起始點(diǎn)保持恒定，層析時(shí)間設(shè)置為30 min，室溫設(shè)定25℃。

噴霧顯色和自顯色：層析結(jié)束取出，在電動點(diǎn)樣機(jī)上烘干，用鑷子夾取薄層板，噴壺均勻噴灑顯色劑兩次，于105℃點(diǎn)樣機(jī)上干燥顯色1 min。與此對應(yīng)，直讀顯色條帶不噴灑顯色劑，僅將展開后的條帶直接放置于加熱板上待其自顯色完成（加熱平板105℃，15 s內(nèi)完成顯色）。

1.7 茶樣HPLC檢測分析

日立L-8900高速全自動氨基酸分析儀及試劑包（分離試劑包 B1~B6，衍生化試劑包R1~R3），分析條件：柱溫：57℃，柱后衍生化反應(yīng)溫度：135℃；分離柱：4.6 mm×60 mm[#2622PH] ， 除 氨 柱 ： 4.6 mm×40 mm[#2650L]，反應(yīng)柱：4.6 mm×40 mm，分離溫度：57℃，衍生溫度：135℃，分離梯度以及其他儀器條件見文獻(xiàn)[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 茚三酮/納米二氧化鈦的表征

通過透射電鏡，可以清晰的觀察到纖維表面構(gòu)筑成的納米顆粒顯色劑，經(jīng)過三層組裝之后，其粒徑分布在20~50 nm之間，見圖2-a，證明在纖維素表面形成了納米二氧化鈦顆粒。將制備好的納米顯色顆粒通過沖洗研磨等手段可以獲得高度分散的茚三酮/納米二氧化鈦分散液（圖2-b），該分散液可以保持近三周穩(wěn)定的懸浮狀態(tài)。

為進(jìn)一步證實(shí)茚三酮被成功構(gòu)筑在納米二氧化鈦結(jié)構(gòu)中，我們將制備好的納米顆粒干燥后進(jìn)行紅外光譜測試，可以佐證茚三酮是否組裝在納米二氧化鈦上形成納米顯色劑復(fù)合物,有關(guān)詳細(xì)信息見附件。

圖2 茚三酮/納米二氧化鈦微觀結(jié)構(gòu)透射電鏡圖及水溶液中高度分散狀態(tài)Fig. 2 Microstructure of ninhydrin/nano-titanium dioxide observed by transmission electron microscopy and highly dispersed state in aqueous solution

將上述制備好的納米顯色劑分散液（10 mg·mL-1）打印在層析板上后，由于納米二氧化鈦的多層包裹和鍵合交聯(lián)作用，納米顯色劑被有效固定且均勻分布在在層析板固定相表面，在層析過程中不會發(fā)生色帶和斑點(diǎn)的擴(kuò)散。此外，由于納米材料的極高比表面積，其顯色的靈敏度獲得提高的同時(shí)，顯色所用的時(shí)間也大大減少。本研究中用于復(fù)合茚三酮使用的納米二氧化鈦，其性質(zhì)穩(wěn)定而且無色，不影響氨基酸的顯色且打印后的層析條帶與原始狀態(tài)無差異，有助于后面的分析顯色過程。

2.2 展開劑優(yōu)化與茶氨酸定性分析

因氨基酸溶液為水相，由于毛細(xì)管吸附力的存在，點(diǎn)樣時(shí)樣液易上移。因此，在點(diǎn)樣和在貯備液配制過程中，均以異丙醇水（V︰V=1︰1）為稀釋液溶解茶氨酸，改變了溶液極性，解決了氨基酸點(diǎn)樣吸附困難的問題。

通過收集國內(nèi)外相關(guān)研究與試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的氨基酸展開劑V正丁醇︰V乙醇︰V水=4︰1︰1層析效果不佳，且耗時(shí)長，正丁醇在薄層板上遷移緩慢。通過反復(fù)對比有關(guān)展開劑并參考有關(guān)研究采用 75%的乙醇溶液作為展開劑[21]，進(jìn)一步優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)V75%乙醇︰V冰乙酸=10︰1作為展開劑效果較好，各氨基酸無明顯拖尾（圖3）。由于各種氨基酸理化性質(zhì)不同，其在吸附劑表面的吸附/解吸附能力各異，經(jīng)展開后各氨基酸形成不同的比移值Rf值如表 1所示。其中，本研究的目標(biāo)化合物茶氨酸的比移值為0.702，與其他 3種氨基酸差異明顯。因此下一步直讀顯色層析板的納米顯色劑打印位置選擇在該比移值處。

2.3 茶湯色素干擾鑒別及脫色

在前述氨基酸展開劑優(yōu)化基礎(chǔ)上，采用制備的直讀顯色條帶對氨基酸標(biāo)準(zhǔn)和茶葉提取液進(jìn)行初步分析，分析結(jié)果如圖4所示。

圖3 4種氨基酸單標(biāo)及混標(biāo)的薄層展開效果（噴霧顯色法）Fig. 3 The TLC (spray colorization) picture of the single standards or mixed standard of four amino acids

表1 4種氨基酸的Rf值Table 1 The shift value (Rf) of four kinds of amino acids

構(gòu)筑的直讀顯色條帶可以對 4種目標(biāo)氨基酸進(jìn)行直讀顯色，標(biāo)準(zhǔn)品顯色效果良好，背景清晰。觀察注意到4種氨基酸單標(biāo)（a~d通道）遷移與4種氨基酸混標(biāo)（e通道）遷移位置完全一致。由于本研究著重分析茶氨酸，因此為避免氨基酸顯色之間相互影響，確定了下一步實(shí)驗(yàn)方案為每個(gè)通道只針對一種氨基酸打印一個(gè)顯色區(qū)。圖4中右圖中4個(gè)通道分別對應(yīng)4種氨基酸，顯色結(jié)果表明茶葉提取物樣品直讀顯色與標(biāo)準(zhǔn)品之間有較大差異，顏色偏黃。推測原因在于樣品提取液中含有較多的共存酚類化合物，這些酚類化合物可與氨基酸顯色過程中產(chǎn)生的醛類化合物形成酚醛類物質(zhì)呈現(xiàn)淡黃色，影響了顯色效果。為此，有必要對茶湯進(jìn)行預(yù)處理。一般認(rèn)為，乙酸乙酯是茶葉中茶多酚、咖啡因的良好提取溶劑，本次實(shí)驗(yàn)中乙酸乙酯萃取后的茶湯顯色與標(biāo)準(zhǔn)品較一致，表明該方法適于該直讀顯色測定的樣品預(yù)處理（圖5）。

圖 5證明該納米顯色材料在茶氨酸定性試驗(yàn)測定中效果較好，顯色條帶集中、干擾顏色信號少，而且顯色耗時(shí)短、靈敏度高。

2.4 茶氨酸半定量分析、最低顯色濃度、顯色范圍

圖6中f、g兩通道為脫色茶湯及脫色茶湯加標(biāo)，將其顏色深淺同圖左茶氨酸標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度進(jìn)行比對，可明顯觀察到f通道顏色深淺在 c和 d通道之間，說明茶湯中的茶氨酸含量介于0.125~0.06 mg·mL-1之間，如取中間值則約0.1 mg·mL-1左右。加標(biāo)濃度可以進(jìn)一步驗(yàn)證該估計(jì)值的準(zhǔn)確（見g通道），加標(biāo)0.10 mg·mL-1后顏色與b通道相接近，表明加入的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸被試紙條帶準(zhǔn)確的識別出來。h和i通道是脫色后茶湯稀釋液直讀檢測及加標(biāo)后顯色結(jié)果，進(jìn)一步驗(yàn)證了本方法的有效性。這種確定的定量關(guān)系還可以通過圖像軟件佐證。將圖片導(dǎo)入電腦系統(tǒng)自帶的普通圖像軟件，對工作曲線原始圖片中各顯色點(diǎn)取RGB值，利用軟件采集獲得每個(gè)工作曲線點(diǎn)的 R值、G值和 B值，各代表紅、綠和藍(lán)色色度值。經(jīng)過多次擬合發(fā)現(xiàn)氨基酸濃度的對數(shù)值和 R值之間有著最好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)可以達(dá)到0.9924。證明本研究中采用裸眼目視比色是可行的，其線性也是可信的。

通過重復(fù)制備多次顯色工作曲線，還可以判斷本方法的最低顯色濃度和線性范圍，在上樣量 2微升時(shí)最低顯色濃度為 0.03 mg·mL-1,最大顯色濃度為1.2 mg·mL-1。

2.5 實(shí)際樣品驗(yàn)證

以 HPLC方法可以對構(gòu)筑的直讀顯色方法展開確證。相關(guān)信息見附件材料，HPLC證明本直讀顯色結(jié)果在可行性范圍內(nèi)，本研究成功構(gòu)筑出一種可以通過肉眼直讀觀察多通道同時(shí)檢測茶葉中氨基酸的直讀顯色條帶。

2.6 納米顯色劑顯色機(jī)理與優(yōu)勢探討

一般而言，在層析完成后層析斑點(diǎn)的面積大小和顏色深度與樣品濃度直接相關(guān)。在本研究中，我們?yōu)榱擞欣谌庋叟袛?，我們統(tǒng)一設(shè)定顯色區(qū)的顏色深淺度作為半定量指標(biāo)，類似于柱色譜中的峰高指標(biāo)。另外，本研究構(gòu)筑的納米顯色劑尺度遠(yuǎn)小于層析板的硅膠固定相顆粒，當(dāng)待測組分遷移到該位置時(shí)，易因?yàn)槊?xì)管吸附作用被硅膠表面打印的納米顯色劑吸附至上層，因而不會產(chǎn)生原來顯色斑點(diǎn)的暈輪現(xiàn)象，即中心顏色深于外周。因此，從這點(diǎn)來說，以顏色深度直接判斷是可行的。

通過一系列合成步驟合成的茚三酮/納米二氧化鈦復(fù)合物既具備了茚三酮作為靈敏顯色劑的功能，也具備了納米二氧化鈦的優(yōu)異性能。純凈的納米二氧化鈦呈純白色，因而不影響后續(xù)的顯色反應(yīng)。顯色后清晰穩(wěn)定可保持3 d左右。而常規(guī)茚三酮噴霧法具有顯色不穩(wěn)定的特點(diǎn)，顯色后易褪色，見圖7中圖和右圖。噴霧法噴灑的茚三酮顯色斑點(diǎn)擴(kuò)散、面積大且模糊，色斑顯色不均勻，邊緣部分出現(xiàn)暗紅色雜質(zhì)，難以裸眼直讀比對顯色結(jié)果。因此，茚三酮/納米二氧化鈦復(fù)合物相較于單純的茚三酮化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，利于長期保存。綜上可知，該納米材料非常適用于茶葉中氨基酸的定性及半定量實(shí)驗(yàn)。本研究尚未對其他幾種氨基酸展開分析，根據(jù)本研究的研究結(jié)果，在今后可繼續(xù)開展對其他幾種氨基酸的直讀分析，有望建立茶葉特定品種的標(biāo)準(zhǔn)譜圖。

圖4 4種氨基酸單標(biāo)及混標(biāo)的直讀顯色條帶顯色效果Fig. 4 The direct-reading coloration results for different amino acid standards

圖5 乙酸乙酯處理后茶湯中的茶氨酸直讀顯色效果Fig. 5 The direct-reading colorimetric result of the theanine in extraction solution of tea after being decolorized by ethyl acetate

圖6 茶氨酸的5個(gè)濃度梯度顯色及脫色茶湯直讀顯色分析Fig. 6 Direct-reading coloration results of five concentration gradients of theanine standard solution and direct coloration analysis of the decolorized extraction solution of tea

圖7 兩種顯色模式的顯色效果對比Fig. 7 The comparison of the two coloration modes

3 結(jié)論

本研究通過構(gòu)筑納米顯色材料，結(jié)合單向展開對脫色茶湯進(jìn)行薄層層析，構(gòu)建出一種便攜的直讀顯色條帶，能快速半定量檢測茶葉茶氨酸。在優(yōu)化后的展開條件下能夠有效地分離茶葉提取物中混合氨基酸，自顯色后條帶色斑均勻清晰，所構(gòu)筑的新型納米顯色劑對目標(biāo)氨基酸茶氨酸實(shí)現(xiàn)了靈敏的直讀顯色，其顏色深淺度與其濃度之間有明確的半定量關(guān)系。最低顯色濃度為 0.03 mg·mL-1，線性范圍在0.03~1.2 mg·mL-1。標(biāo)準(zhǔn)品添加法以及 HPLC法均證明該法可靠性好。與傳統(tǒng)層析方法檢測氨基酸相比，本研究構(gòu)建的直讀顯色條帶具有顯色穩(wěn)定、簡便快捷等優(yōu)勢，在農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)鑒定與現(xiàn)場快速檢測氨基酸等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

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