王定鋒，李良德，李慧玲，張輝，王慶森，吳光遠(yuǎn)

福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建 福安 355015

茶大灰象甲(Sympiezomias citri)又名柑橘灰象甲，屬鞘翅目（Coleoptera）象甲科（Curculionidae），是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要以成蟲咀食茶樹、柑橘、桑樹和油茶等多種經(jīng)濟作物的嫩芽枝葉為害為主，造成葉片殘缺不全，也可啃食幼果使果面殘留傷痕，甚至造成落果歉收，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。近年來，人們對食品安全問題的關(guān)注程度越來越高，促進(jìn)了茶園、柑橘園等傳統(tǒng)種植業(yè)向無公害和有機農(nóng)業(yè)發(fā)展。但這種農(nóng)業(yè)管理模式卻使得茶大灰象甲的發(fā)生危害出現(xiàn)逐年加重的趨勢，常爆發(fā)成災(zāi)[3-4]。長期以來，對茶大灰象甲主要還是以化學(xué)防治為主[4-9]?；瘜W(xué)防治雖然在一定程度上可以快速有效地防治該象甲，但化學(xué)農(nóng)藥的長期大量使用所引起的農(nóng)業(yè)“3R”問題，嚴(yán)重影響生態(tài)環(huán)境和人類健康。物理防治和農(nóng)業(yè)防治雖然具有一定的效果，但耗時費力，不利于大面積的防治。因此，有必要尋找更加合適的防治手段來控制茶大灰象甲的發(fā)生和危害。

布氏白僵菌（Beauveria brongniartii），又名卵孢白僵菌，是一種重要的昆蟲病原真菌，可寄生7個目70多種昆蟲，尤其對鞘翅目害蟲具有獨特的寄生效果，被廣泛用于農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)中金龜子和天牛等鞘翅目害蟲的防治[10-14]。據(jù)Faria統(tǒng)計，全球（除中國外）已登記的171個真菌殺蟲劑產(chǎn)品中，有7個產(chǎn)品是以布氏白僵菌為有效成份[15]。然而，當(dāng)前還未見利用布氏白僵菌防治茶大灰象甲的報道。本研究對從茶大灰象甲自然羅病死亡的僵蟲中分離到的一株昆蟲病原真菌菌株的分類地位進(jìn)行了分子鑒定，并測定其對茶大灰象甲成蟲的毒力，旨在為今后利用該菌防治茶大灰象甲奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蟲生真菌 Bbr4941菌株分離自自然羅病死亡的茶大灰象甲成蟲僵蟲（僵蟲采集自福建省福安市社口鎮(zhèn)茶園），并用薩氏培養(yǎng)基Sabouraud dextrose agar plus 1% yeast extract（SDAY）試管斜面保存于4℃冰箱中。

1.2 培養(yǎng)基

薩氏培養(yǎng)基（SDAY）：4%葡萄糖、1%酵母、1%蛋白胨、2%瓊脂，pH 7.0。高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min。

1.3 供試蟲源

于茶大灰象甲成蟲發(fā)生高峰期，從茶園中采集成蟲帶回實驗室，用新鮮茶梢飼養(yǎng)。2 d后挑選健康活躍、大小基本一致的成蟲用于室內(nèi)毒力測定。

1.4 菌株分子生物學(xué)鑒定

以菌株Bbr4941基因組DNA為模板，采用真菌通用引物ITS 1 （5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′） /ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′）[16]PCR擴增菌株rDNA-ITS序列；采用引物 B5.1F（5′-CGACCCGGC CAACTACTTTGA-3′） /B3.1R （ 5′-GTCTTC CAGTACCACTACGCC-3′）[17]擴增菌株 Bloc序列。rDNA-ITS序列和Bloc序列的PCR反應(yīng)程序都為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，70℃ 30 s，30個循環(huán)；70℃延伸5 min。兩個片段的PCR反應(yīng)體系都為：2×TaqMix 10 μL，模板 DNA 1 μL，引物（10 mmoL）各 1 μL，ddH2O 12 μL，總共 25 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收純化，送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。分別將rDNA-ITS序列和 Bloc序列測序結(jié)果通過 Blastn程序（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與在GenBank中的基因序列進(jìn)行同源性分析。下載常見近緣種的 rDNA-ITS序列和 Bloc序列，分別用MEGA4.0軟件ClustalX方法進(jìn)行多序列比對，并以鄰接法（neigbor-joining method）分別構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，用 Bootstrap對系統(tǒng)樹進(jìn)行檢驗，1 000次重復(fù)[18]。

1.5 菌株對茶大灰象甲成蟲毒力測定

從SDAY平板上培養(yǎng)15 d的Bbr4941菌株中收集分生孢子，用0.05%吐溫-80溶液攪拌 均 勻 ， 配 成 每 毫 升 5.0×107、 1.0×107、5.0×106、1.0×106孢子4種孢懸液。參照王定鋒等[19-20]的方法進(jìn)行浸蟲處理及培養(yǎng)，具體操作為：茶大灰象甲成蟲浸入孢懸液3~5 s后，立即取出，用無菌濾紙去除多余菌液后置于容量為1 L的塑料杯中，并用基部包有濕潤的無菌脫脂棉的新鮮茶枝飼養(yǎng)，每2 d更換1次茶枝。塑料杯口用紗網(wǎng)封住，置于人工氣候箱中（25℃、95%相對濕度和12L/12D的光周期）。每個濃度為 1個處理，每個處理15頭茶大灰象甲成蟲，重復(fù)3次，以0.05%吐溫-80溶液為對照。從處理后第2天開始，每天定時觀察各處理的死亡情況、做好記錄，同時將死蟲移出放于盛有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)，觀察菌絲生長及產(chǎn)孢情況，并統(tǒng)計死亡率、校正死亡率和僵蟲率（蟲尸上長出肉眼可見的菌絲及孢子），并按照以下公式計算：

死亡率=死亡蟲口數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%；

校正死亡率＝（處理組死亡率－對照組死亡率）/（1－對照組死亡率）×100%；

僵蟲率=死亡后形成僵蟲的蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 昆蟲病原真菌Bbr4941的分子鑒定

昆蟲病原真菌Bbr4941菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列PCR擴增、測序，分別獲得長度為590 bp和1 494 bp的基因片段，GenBank登錄號分別是MG837273和MG837274。通過Blast與GenBank中已有的核酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明，與Bbr4941菌株rDNA-ITS序列和Bloc序列相似性達(dá)100%的大部分序列分別都是布氏白僵菌的rDNA-ITS序列和Bloc序列。為進(jìn)一步明確菌株Bbr4941與幾種常見白僵菌的親緣關(guān)系，分別選擇GenBank中已公布的或Rehner等報道[17]中確認(rèn)的6種分類地位比較明確的白僵菌[多形白僵菌（Beauveria.amorpha）、（狹義）球孢白僵菌（B. bassiana）、布氏白僵菌（B. brongniartii）、蘇格蘭白僵菌（B.caledonica）、馬拉維白僵菌（B.malawiensis）和蠕孢白僵菌（B.vermiconia）]的rDNA-ITS序列和Bloc序列，分別用MEGA 4.0軟件鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1，圖2）。從圖1和圖2兩個系統(tǒng)發(fā)育樹都可以看出，菌株Bbr4941與其他布氏白僵菌聚在一個較小的進(jìn)化分支上，具有很高的同源性，因此我們判定昆蟲病原真菌Bbr4941菌株為布氏白僵菌。

2.2 布氏白僵菌Bbr4941對茶大灰象甲成蟲的毒力

從圖3可以看出，隨著布氏白僵菌Bbr4941孢子濃度的增加和處理時間的推移，茶大灰象甲成蟲的死亡率不斷升高。每毫升5.0×107和1.0×107孢子處理時，第4天試蟲開始大量死亡；第7天累計死亡率分別為100%和97.22%。每毫升5.0×106、1.0×106孢子處理時，從第5天開始，試蟲死亡率才開始大量增加，第7天累計死亡率分別為75%和61.11%。從表1可以看出，布氏白僵菌Bbr4941對茶大灰象甲成蟲的殺蟲毒力存在明顯的時間-劑量效應(yīng)。孢子濃度越高，茶大灰象甲成蟲的LT50值越小。當(dāng)達(dá)到每毫升1.0×106~5.0×107孢子時，處理7 d，茶大灰象甲成蟲死亡率為61.11%~100%，LT50值為5.921~3.916 d。應(yīng)用SPSS軟件的probit程序計算出布氏白僵菌Bbr4941對茶大灰象甲成蟲第7天的LC50值為每毫升8.33×105孢子，95%置信區(qū)間為每毫升2.43×105~1.49×106孢子。

3 討論

昆蟲病原真菌侵染寄主包含體表附著、體壁穿透和體內(nèi)定殖3個階段，整個過程涉及寄主識別、機械破壞、營養(yǎng)競爭、代謝干擾、毒素分泌及寄主組織結(jié)構(gòu)破壞等，這些因子共同作用最終導(dǎo)致寄主死亡[21]。這種獨特的殺蟲方式，使害蟲不能產(chǎn)生抗性，且具有易于生產(chǎn)、環(huán)境兼容性好和對靶標(biāo)害蟲專一等優(yōu)勢，在茶大灰象甲的田間大面積防治上具有極大的應(yīng)用潛力。本研究獲得的布氏白僵菌 Bbr4941孢懸液（每毫升5.0×107孢子）處理茶大灰象甲成蟲7 d，其累計校正死亡率為100%，LT50為3.916 d；該結(jié)果與王定鋒等[22]通過室內(nèi)毒力測定，從15株白僵菌菌株中篩選出的對茶大灰象甲成蟲高毒力的球孢白僵菌菌株Bb2-1的殺蟲活性相當(dāng)，說明布氏白僵菌Bbr4941也具有很強的殺蟲活性和生防潛力。此外，本研究獲得的茶大灰象甲寄生菌 Bbr4941為布氏白僵菌，在分類上與球孢白僵菌屬于同屬不同種，這也進(jìn)一步豐富了茶大灰象甲生防真菌的資源庫，將在今后茶大灰象甲的田間防治中發(fā)揮重要作用。

圖1 基于rDNA-ITS序列的Bbr4941菌株及白僵菌類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 Phylogeny analysis of rDNA-ITS gene sequences of Bbr4941 and Beauveria

圖2 基于Bloc序列的Bbr4941菌株及白僵菌類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogeny analysis of Bloc gene sequences of Bbr4941 and Beauveria

圖3 白僵菌Bbr4941不同孢子濃度對茶大灰象甲成蟲的毒力Fig. 3 The toxicity of Bbr4941 against the adults of S. citri

表1 不同孢子濃度下菌株Bbr4941對茶大灰象甲成蟲的毒力Table1 Virulence of the strain Bbr4941 against adults of S. citri under different spore concentrations

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，GenBank數(shù)據(jù)庫中真菌的各種標(biāo)記序列不斷增多，給真菌新菌株的分子鑒定奠定了堅實的基礎(chǔ)。Johny等[23]通過對 ITS，EF1-a和 Bloc片段的擴增和測序，從分子水平上對分離自鞘翅目害蟲（Agrilus planipennis）爆發(fā)的森林中分離到的78個白僵菌菌株進(jìn)行鑒定，并明確了這些菌株的分類地位。Carrillo-Benítez等[24]利用ITS和EF1-a對分離自蠐螬幼蟲的17株白僵菌進(jìn)行了分子鑒定，發(fā)現(xiàn)所有的白僵菌都屬于（Beauveria pseudobassiana）。為明確從瑞士境內(nèi)獲得的花粉甲蟲白僵菌的分類歸屬，Meyling等[25]通過對菌株 ITS，EF1-a和 Bloc片段的擴增和測序，最終確定了這些白僵菌包括球孢白僵菌和布氏白僵菌。Medo等[26]利用ITS和Bloc序列對分離自斯洛伐克土壤的109個白僵菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明這些菌株包括B. bassiana，B. pseudobassiana和B.brongniartii3大類。本研究通過對分離自茶大灰象甲僵蟲的昆蟲病原真菌 Bbr4941菌株的rDNA-ITS序列和Bloc序列的擴增、測序和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，明確了所獲得的Bbr4941菌株是布氏白僵菌，該結(jié)果也進(jìn)一步證實了前人利用真菌常用標(biāo)記序列可有效地對新分離到的菌株進(jìn)行分子鑒定的結(jié)論[23-26]。

[1] 張漢鵠, 譚濟才. 中國茶樹害蟲及其無公害治理[M]. 合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社, 2004: 238-239.

[2] 蔡明段, 易干軍, 彭成績. 柑橘病蟲害原色圖鑒[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2011: 197-198.

[3] 王龍江, 陸家逸, 毛潤乾. 有機金桔園柑桔灰象甲調(diào)查初報[J]. 中國南方果樹, 2009, 38(6): 59-60.

[4] 張小亞, 陳國慶, 黃振東, 等. 柑橘灰象甲的生物學(xué)特性及防治措施[J]. 浙江柑橘, 2011, 28(3): 21-22.

[5] 洪若豪. 福建柑桔大害蟲——灰鱗象鼻蟲[J]. 昆蟲知識,1960, 6(1): 16-17.

[6] 洪若豪. 福建柑橘大灰象甲（Sympiezomia lewisiRoel.）生活習(xí)性及防治初步研究[J]. 植物保護(hù)學(xué)報, 1965, 4（2）：143-148.

[7] 王旗針, 楊小弟. 柑桔灰象甲的生活習(xí)性及防治[J] .江西園藝, 2002, 4: 10.

[8] 余舜堯, 汪榮灶. 茶樹食葉象蟲的發(fā)生與控制措施[J]. 江西農(nóng)業(yè)科技, 2004, 6: 30.

[9] 畢旭燦, 方泉壽, 徐有濱, 等. 常山胡柚灰象甲的發(fā)生與防治對策[J]. 浙江柑橘, 2006, 23(3): 30-32.

[10] 呂利華, 馮明光. 布氏白僵菌昆蟲寄主名錄[J]. 中國生物防治, 1995, 3: 144-144.

[11] 農(nóng)向群. 布氏白僵菌的研究與應(yīng)用[J]. 植物保護(hù)學(xué)報,2000, 27(1): 84-87.

[12] Zimmermann G. Review on safety of the entomopathogenic fungiBeauveria bassianaandBeauveria brongniartii[J].Biocontrol Science and Technology, 2007, 17(6): 553-596.

[13] 蘇品, 廖曉蘭, 張亞, 等. 白僵菌防治花生地蠐螬研究綜述[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 40(4): 373-377.

[14] 林華峰, 王萍莉, 張磊, 等. 布氏白僵菌和金龜子綠僵菌兩變種的生長性狀及其對蠐螬的毒力測定[J]. 中國生物防治, 2006, 22 (2): 123-127.

[15] Faria MR de, Wraight SP. Mycoinsecticides and Mycoacaricides: A comprehensive list with worldwide coverage and international classification of formulation types [J].Biology Control, 2007, 43: 237-256.

[16] White TJ, Bruns T, Lee S, et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］//Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, et al.PCR protocols: a guide to methods and applications. San Diego: Academic Press, 1990: 315-322.

[17] Rehner SA, Posada F, Buckley EP, et al. Phylogenetic origins of African and NeotropicalBeauveria bassianas.l.pathogens of the coffee berry borer,Hypothenemus hampei[J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2006, 93(1): 11-21.

[18] Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24:1596-1599.

[19] 王定鋒, 曾明森, 王慶森, 等. 球孢白僵菌不同分離株生物學(xué)特性及對茶麗紋象甲成蟲的殺蟲活性研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012, 27(7): 750-754.

[20] 王定鋒, 李良德, 黎健龍, 等. 茶角胸葉甲高毒力球孢白僵菌菌株的篩選[J]. 茶葉科學(xué), 2017, 37(3): 229-236.

[21] Clarkson JM, Charnley AK. New insights into the mechanisms of fungal pathogenesis in insects [J]. Trends in Microbiology, 1996, 4(5): 197-203.

[22] 王定鋒, 黎健龍, 王慶森, 等. 柑橘灰象甲一株高毒力白僵菌菌株的篩選鑒定及培養(yǎng)特性[J]. 中國生物防治學(xué)報,2014, 30(6): 750-758.

[23] Johny S, Kyei-Poku G, Gauthier D, et al. Characterization and virulence ofBeauveriaspp. recovered from emerald ash borer in southwestern Ontario, Canada [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 111: 41-49.

[24] Carrillo-Benítez MG, Guzmán-Franco AW, Alatorre-Rosas R,et al. Diversity and genetic population structure of fungal pathogens infecting white grub larvae in agricultural soils [J].Microbial ecology, 2013, 65: 437-449.

[25] Meyling NV, Pilz C, Keller S, et al. Diversity ofBeauveriaspp. isolates from pollen beetlesMeligethes aeneusin Switzerland [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 109(1): 76-82.

[26] Medo J, Michalko J, Medová J, et al. Phylogenetic structure and habitat associations ofBeauveriaspecies isolated from soils in Slovakia [J]. Journal of Invertebrate Pathology, 2016,140: 46-50.