劉思怡，朱曉靜，房峰祥，張豪杰，邱安東，陳玉瓊

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢, 430070

氟是人和動(dòng)物必需的微量元素，適量的氟攝入可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物骨骼中的磷酸鈣轉(zhuǎn)化為磷灰石，有利于防止齲齒和骨質(zhì)變形癥等[1-2]，但是過量攝入氟會(huì)造成軟組織硬化，干擾人體鈣代謝和骨組織中膠原蛋白合成等[1-4]。茶樹（Camellia sinensis）是富集氟能力較強(qiáng)的幾種植物之一，葉片是茶樹富集氟的主要器官，飲茶成為人們攝入氟的渠道之一，因此，茶氟安全也備受人們的關(guān)注。茶葉中氟含量受品種、栽培環(huán)境、葉片成熟度等多種因素的影響[5-6]。自然生長(zhǎng)狀態(tài)下，茶樹葉片富集氟的量從幾十至 1 000 mg·kg-1以上而未表現(xiàn)出中毒癥狀，是生長(zhǎng)于同一地點(diǎn)其他植物的10~100倍[7-8]，表明茶樹對(duì)氟有極強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力。已有研究表明，植物超富集某種元素的能力與其對(duì)超富集元素在細(xì)胞和亞細(xì)胞水平上的區(qū)隔化密切相關(guān)[9]。李剛等[10]研究發(fā)現(xiàn)，小麥根系上的 77% Al吸附于細(xì)胞壁上。FeiBo研究表明，大麥中Cd主要分布在根或枝梢細(xì)胞壁及可溶性組分里[11]。李春雷、蔡薈梅等研究發(fā)現(xiàn)，水培條件下的茶樹幼苗在氟脅迫下，茶樹葉片氟含量隨培養(yǎng)液氟濃度增加而增加，其中細(xì)胞壁和可溶性部分是葉片氟主要的存儲(chǔ)部位[12-13]。而在自然生長(zhǎng)條件下，茶樹葉片氟的富集部位及其亞細(xì)胞分布是否具有同樣規(guī)律？細(xì)胞壁作為結(jié)合氟的重要部位，其結(jié)合氟的可能機(jī)理是什么？對(duì)此，本文分析了同一生長(zhǎng)條件下3個(gè)具有不同聚氟能力的茶樹品種氟的亞細(xì)胞分布及氟與細(xì)胞壁的結(jié)合特點(diǎn)，以期為明確茶樹富氟的機(jī)理，為健康飲茶及茶樹低氟品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶葉原料：鮮葉采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶園的烏牛早（WNZ）、福鼎大白（FD）、福云 6號(hào)（FY No.6）品種的成熟葉片，采回的鮮葉經(jīng)蒸餾水洗凈后晾干，–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)所用Trisbase（三羥甲基氨基甲烷）、果膠酶（CalBio M0002）、纖維素酶均購(gòu)置于Biosharp公司；DTE（二硫赤鮮醇）購(gòu)置于北京索萊寶科技有限公司；CDTA（反式-1,2-環(huán)己二胺四乙酸）購(gòu)置于成都市科龍化工試劑廠；高氯酸，過氧化氫，咪唑，鹽酸羥胺，蔗糖等其他化學(xué)試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1亞細(xì)胞組分分離

亞細(xì)胞組分采用差速離心法[11]。稱取一定量新鮮葉片，加入預(yù)冷過的緩沖液（50 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1蔗 糖 ， 1.0 mmol·L-1DTE ， 5.0 mmol·L-1抗 壞 血 酸（pH7.5），料液比 1︰40（g·mL-1），研磨勻漿。勻漿過100 μm尼龍網(wǎng)，濾渣用緩沖液淋洗2次，濾渣為細(xì)胞壁組分（F1）。上清液在4 500 r·min-1下離心 15 min，沉淀為細(xì)胞核和葉綠體組分（F2）。收集離心后的上清液在15 000 r·min-1下離心 35 min，沉淀為線粒體組分（F3），上清液為含核糖體的可溶性組分（F4），所有操作均在4℃下進(jìn)行，冷凍干燥得所需樣品。

1.2.2 細(xì)胞壁組分分離

參照文獻(xiàn)[14]的方法。取 1.2.1中所得細(xì)胞壁組分，用預(yù)冷磷酸緩沖（pH7.0）淋洗殘?jiān)弦罕?︰100，g·mL-1），除去水溶性物質(zhì)。然后用–20℃預(yù)冷丙酮（1︰50，g·mL-1）淋洗除去脂溶性物質(zhì)，再用少量緩沖液淋洗，抽干，最后用 LiCl（3 mol·L-1，檸檬酸-磷酸緩沖液配制，pH5.5，）4℃下浸泡24 h（料液比 1︰10，g·mL-1），除去蛋白質(zhì)，抽干，殘余物冷凍干燥。

取適量上述樣品于離心管，按料液比1︰40（g·mL-1）加入 0.5 mol·L-1咪唑溶液（pH 7.0），在 25℃下振蕩提取 24 h，5 000 r·min-1離心20 min，沉淀物用咪唑溶液洗滌2~3次，合并上清液，冷凍干燥得螯合態(tài)果膠（CW-P1）；沉淀物加入 50 mmol·L-1Na2CO3（內(nèi)含 20 mmol·L-1CDTA），按上述同樣條件，離心后的上清液冷凍干燥即為堿溶性果膠（CW-P2）；沉淀物用4 mol·L-1KOH按同樣條件提取，離心后的上清液用 4 mol·L-1HCl中和至 pH5.0，冷凍干燥即為半纖維素（CW-HC）；殘?jiān)鋬龈稍锛礊槔w維素（CW-C）。

1.2.3 細(xì)胞壁化學(xué)改性

參照文獻(xiàn)[15]的方法。將茶樹鮮葉按 1︰10（g·mL-1）加入-20℃預(yù)冷 75%乙醇溶液勻漿，5 000 r·min-1離心，沉淀用預(yù)冷75%乙醇溶液浸提 2次，每次于 4℃下 5 000 r·min-1離心 10 min。沉淀物依次用預(yù)冷的丙酮、甲醇-三氯甲烷混合液（l︰l，V/V）和甲醇溶液進(jìn)行洗滌，沉淀物冷凍干燥即為細(xì)胞壁，液氮磨碎，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)胞壁甲基化改性：稱取2 g細(xì)胞壁于錐形瓶中，加入80 mL甲酸和40 mL甲醛，置于25℃恒溫?fù)u床振蕩反應(yīng)6 h，振蕩轉(zhuǎn)速125 r·min-1。反應(yīng)結(jié)束后離心分離，沉淀物用去離子水沖洗3次，得到經(jīng)甲基化改性處理后的細(xì)胞壁，冷凍干燥后，4℃保存?zhèn)溆谩?duì)照組用相應(yīng)量的純水代替甲酸、甲醛，其余處理同改性組。

細(xì)胞壁酯化改性：稱取2 g細(xì)胞壁于錐形瓶中，先加入140 mL無(wú)水甲醇，再加入1.2 mL濃 HCl。懸浮液在 125 r·min-1下振蕩 12 h，離心后沉淀物用去離子水洗滌3次，冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆?。?duì)照組用相應(yīng)量的純水代替甲醇和濃鹽酸，其余步驟同處理組。

1.2.4 果膠酶、纖維素酶酶解

果膠酶酶解：取2 g細(xì)胞壁于錐形瓶中，加入120 mL l%果膠酶及0.1% BSA（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制，pH3.5）?；旌暇鶆蚝笤?0℃水浴中酶解2 h，離心分離沉淀，去離子水洗滌3次，冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆?。?duì)照組用相應(yīng)量失活的果膠酶和BSA處理。

纖維素酶酶解：取 2 g細(xì)胞壁于錐形瓶中，加入120 mL l%纖維素酶及0.1% BSA（檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制，pH 5.0）?；旌暇鶆蚝笤?50℃水浴中酶解 2 h，離心分離沉淀，去離子水洗滌3次，冷凍干燥后4℃保存?zhèn)溆?。?duì)照組用相應(yīng)量失活的纖維素酶和BSA處理。

1.2.5 氟的測(cè)定

氟含量測(cè)定：采用堿熔灰化-氟電極測(cè)定，參照文獻(xiàn)[16]。

不同組分氟所占細(xì)胞壁總氟的百分含量換算方法：（不同組分氟含量×該組分的質(zhì)量）/細(xì)胞壁總氟量。

1.2.6 金屬離子含量

準(zhǔn)確稱取樣品0.1 g于錐形瓶中，加10 mL混合酸（V硝酸︰V高氯酸=4︰1），置于電熱板上慢慢升溫加熱至 140~180℃，使黃棕色煙（NO2）慢慢揮發(fā)，再適當(dāng)提高溫度繼續(xù)消化，消化至消化液呈無(wú)色透明，冷卻至室溫后將消化液過濾，轉(zhuǎn)移至 25 mL容量瓶，超純水定容?；鹧?原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定金屬離子含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)表示為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用 SPSS（17.0）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，最小顯著差數(shù)法（LSD法）進(jìn)行多重比較分析。以百分?jǐn)?shù)為單位的數(shù)據(jù)先做平方根反正弦轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹葉片氟的亞細(xì)胞分布

從圖1~2可以看出，茶樹葉片亞細(xì)胞組分中氟含量存在顯著差異（P<0.05），3個(gè)品種的細(xì)胞壁組分氟含量都最高，烏牛早、福云6號(hào)和福鼎大白細(xì)胞壁氟含量分別為2 676.94、2 225.42、1 854.79 mg·kg-1，占葉片總氟的39.74%、50.63%和 56.42%。其次是細(xì)胞核和葉綠體組分，含量分別為1 037.51、756.54、750.80 mg·kg-1，占葉片總氟的 15.59%、14.68%和 21.54%。可溶性組分氟含量最低，分別為320.74、244.89、288.41 mg·kg-1，但由于該組分在細(xì)胞中的總量較高，因此，其所含的氟總量占葉片總氟的31.35%、28.35%和37.32%，僅次于細(xì)胞壁組分。線粒體組分中氟含量分別為 686.93、457.63、395.82 mg·kg-1，所含氟總量?jī)H為葉片氟總量的0.55%，1.39%和2.43%，氟分布量最少。

2.2 氟在細(xì)胞壁各組分中的分布

細(xì)胞壁中累積了大量氟，進(jìn)一步分離褔云6號(hào)細(xì)胞壁組分，分析葉片細(xì)胞壁組分氟含量分布。結(jié)果表明，細(xì)胞壁各組分對(duì)氟的富集能力差異顯著（圖3~4）。螯合態(tài)果膠組分氟含量最高，為 1 400.14 mg·kg-1，占細(xì)胞壁總氟的 38.58%；其次為堿溶性果膠，氟含量為1091.47 mg·kg-1，但由于該組分在細(xì)胞壁中的總量較少，因此其所含的氟僅占細(xì)胞壁總氟的16.86%；半纖維素氟含量為 241.91 mg·kg-1，占細(xì)胞壁總氟的36.60%；纖維素氟含量最低，為 167.68 mg·kg-1，顯著低于其他組分中氟含量（P＜0.05），占細(xì)胞壁總氟的7.96%。

圖1 氟在茶樹葉片中的亞細(xì)胞分布Fig. 1 Subcellular distribution of F in tea leaves

圖2 茶樹葉片中氟亞細(xì)胞分布的相對(duì)比例Fig. 2 Relative F percentages in subcellular fractions of tea leaves

圖3 氟在茶樹葉片細(xì)胞壁各組分的分布Fig. 3 F distribution in cell wall fractions

圖4 茶樹葉片細(xì)胞壁各組分中氟分布的相對(duì)比例Fig. 4 Relative F percentages in cell wall fractions

2.3 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化對(duì)結(jié)合氟的影響

為探究葉片細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化對(duì)結(jié)合氟的影響，對(duì)葉片細(xì)胞壁進(jìn)行了甲基化、酯化改性和酶解處理。結(jié)果（圖5）表明，細(xì)胞壁甲基化和酯化后氟含量顯著降低，比對(duì)照分別降低55.82%和 27.54%，細(xì)胞壁分別經(jīng)纖維素酶和果膠酶處理后氟含量的變化和對(duì)照處理差異均不顯著。說明，細(xì)胞壁中基團(tuán)發(fā)生改變，對(duì)結(jié)合氟影響較大；而細(xì)胞壁中纖維素和果膠分子鏈大小對(duì)細(xì)胞壁結(jié)合氟的作用影響不明顯。

2.4 細(xì)胞壁金屬離子對(duì)結(jié)合氟的影響

2.4.1 細(xì)胞壁組分金屬離子含量

由試驗(yàn)結(jié)果（表1）可以看出，茶樹葉片細(xì)胞壁組分中 F與 Ca2+、Mn2+和 Al3+具有顯著正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)分別為 0.749、0.841和 0.844，提示這幾種金屬元素可能對(duì)細(xì)胞壁結(jié)合氟起著重要作用。

2.4.2 細(xì)胞壁改性后金屬離子及氟含量變化

茶樹葉片細(xì)胞壁經(jīng)改性后金屬離子和氟含量如圖6所示。細(xì)胞壁經(jīng)甲基化處理后，隨著氟含量的降低，鎂、鐵、鈣、錳和鋁離子含量較對(duì)照組下降顯著，分別降低 82.08%、26.47%、31.27%、65.44%和 34.03%（圖 6-A）；酯化改性后鎂、鐵、鈣、錳和鋁離子含量較對(duì)照分別降低63.84%、14.71%、73.46%、62.16%和26.09%（圖6-B）。

纖維素酶酶解處理細(xì)胞壁后鎂含量顯著降低，鈣、鐵、錳和鋁金屬離子含量變化不顯著（圖6-C）；果膠酶酶解后鎂、鐵含量顯著降低，而其他元素變化不明顯（圖6-D）。

圖5 細(xì)胞壁改性后氟含量變化Fig. 5 The F content of cell wall with methylation modification

表1 細(xì)胞壁組分氟和金屬離子含量及相關(guān)系數(shù)Table 1 Correlation coefficients of F and metallic elements in subcellular fractions mg·g-1

3 討論

茶樹對(duì)氟的高耐受性及強(qiáng)富集性，表明茶樹體內(nèi)必然存在著某種解毒機(jī)制。本文通過對(duì)茶樹葉片中氟的亞細(xì)胞分布及其與細(xì)胞壁結(jié)合特性研究，發(fā)現(xiàn)在茶樹3個(gè)品種烏牛早、福鼎大白和福云六號(hào)中，均表現(xiàn)為茶樹葉細(xì)胞壁氟（1 854.79~2 676.94 mg·kg-1）最高，占細(xì)胞氟總量的 39.74%~56.49%，其次是可溶性組分，氟含量占細(xì)胞總量28.35%~37.32%，表明細(xì)胞壁和可溶性部分是茶樹氟富集的最主要部位，這與重金屬等元素在相關(guān)抗性植物亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的分布規(guī)律相似[17-21]?？扇苄越M分包括細(xì)胞質(zhì)和液泡。液泡中含有豐富蛋白質(zhì)，有機(jī)酸和有機(jī)植物堿等物質(zhì)，是植物積累和貯存養(yǎng)料及多種代謝產(chǎn)物的重要器官，胞質(zhì)中過剩的中間產(chǎn)物可被液泡吸收和貯存，減少對(duì)酶和細(xì)胞器的傷害[22]。植物液泡對(duì)過剩物質(zhì)或有毒物質(zhì)的區(qū)隔化作用已被很多研究證實(shí)，如在高鋁介質(zhì)中，大麥根細(xì)胞內(nèi)Al3+通過Al3+/nH+交換機(jī)制貯存于液泡當(dāng)中[17]；蜈蚣草羽葉胞液是砷富集的最主要部位，減少了砷對(duì)蜈蚣草的毒性作用[19]。茶樹吸收的氟一部分貯存于液泡中，可有效減少氟對(duì)細(xì)胞器的毒害作用，這可能也是茶樹耐氟的重要原因之一。植物細(xì)胞壁主要是由多糖、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等組成的一個(gè)復(fù)合體，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育及各種逆境脅迫響應(yīng)，是重金屬離子及其他有害元素進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的第一道屏障[23]。細(xì)胞壁中的蛋白質(zhì)、多糖和果膠等生物大分子含有醛基、羧基、氨基和磷酸鹽等基團(tuán)結(jié)構(gòu)，可提供大量離子交換位點(diǎn)[24-25]。

圖6 細(xì)胞壁改性后金屬離子及氟含量變化Fig. 6 The changes of metal ion and F contents in modified cell wall

本文研究表明，細(xì)胞壁中累積了葉片40%以上的氟，其中，果膠螯合的氟最多，占細(xì)胞壁氟55%以上，其次為半纖維素，占細(xì)胞壁氟36%以上。果膠和半纖維素都含有大量官能團(tuán)-OH、-COOH、-CHO，可通過氫鍵、共價(jià)鍵、酯鍵、離子鍵等與蛋白質(zhì)、其他糖分子、金屬離子和氟離子結(jié)合形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)共聚體，維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)。細(xì)胞壁經(jīng)甲基化和酯化處理后，氟和鎂、鐵、鈣、錳和鋁等金屬離子含量顯著減少，而果膠酶和纖維素酶處理后，除鎂、鐵外，其他離子變化不明顯，說明-COOH和-NH2可能在結(jié)合氟及金屬離子中起主要作用，而糖分子鏈長(zhǎng)短對(duì)結(jié)合氟及金屬離子作用不明顯。通過對(duì)細(xì)胞壁中金屬離子與氟含量的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Ca2+、Mn2+和Al3+與F具有顯著正相關(guān)，推測(cè)這幾種金屬離子在細(xì)胞壁結(jié)合氟方面發(fā)揮重要作用。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，茶樹葉片中氟主要存在于細(xì)胞壁和可溶性組分中，細(xì)胞壁結(jié)合氟可能有兩種形式，一方面氟可能與細(xì)胞壁中的-NH2、-COOH和-OH以氫鍵形式存在，另一方面與細(xì)胞壁中的金屬離子以離子鍵結(jié)合而間接被細(xì)胞壁固定。細(xì)胞壁和液泡對(duì)氟的蓄積作用可能是茶樹免遭氟毒害的重要機(jī)制之一。

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