高潔 嚴敏 付婷 邵中軍

流感作為常見病, 有季節(jié)性流行的特點, 病原菌種類較多, 不同病毒有不同檢測手段［1］。明確何種病毒所致, 對于進一步治療有很大幫助, 乙型流感病毒作為僅在人之間傳播的一種疾病, 與甲型流感病毒患病表現(xiàn)十分相似［2-4］。根據(jù)乙型流感病毒的核酸特點, 進行TapMan熒光定量RT-PCR快速檢測現(xiàn)采用較多, 為了探究其效果, 選取不同病毒和送檢樣本進行實驗, 現(xiàn)將結(jié)果整理如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2017年1～4月送至本實驗室檢驗的確診感染乙型流感病毒的咽拭子24例(均經(jīng)血清學檢測, 確診為乙型流感病毒), 由北京生物制品研究所提供的甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒,以及用于效價滴定的MDCK細胞。

1.2 試劑 由北京奧科生物技術(shù)有限責任公司提供, 引物為乙型流感病毒核酸基因NP的一段保守序列, 只含有一級結(jié)構(gòu), 堿基數(shù)量在20個以內(nèi), 各引物不互補；探針5’端識別 FAM, 3’端識別 TAMRA［5］。

1.3 方法 ①選擇MDCK細胞將乙型流感病毒進行效價滴定, 分別制成不同濃度的制劑(10.00、1.00、0.10、0.01 TCID50/管), 待實驗使用。②選擇RT-PCR試劑盒(由NEB公司生產(chǎn)), 進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增, 35次循環(huán)后取產(chǎn)物, 觀察特異性條帶的存在情況。③提取甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒的核酸, 進行TapMan熒光定量RT-PCR檢測。④對不同濃度的乙型流感病毒制劑分別進行常規(guī)RT-PCR和TapMan熒光定量RTPCR檢測。⑤采用常規(guī)RT-PCR和TapMan熒光定量RTPCR檢測送檢的咽拭子樣本, 并與血清學檢查結(jié)果對比。

1.4 觀察指標 ①記錄TapMan熒光定量PT-PCR對于不同病毒檢測的特異性。②記錄常規(guī)RT-PCR和TapMan熒光定量RT-PCR檢測對于不同濃度的乙型流感病毒的敏感性。③記錄對比常規(guī)RT-PCR和TapMan熒光定量RT-PCR檢測咽拭子樣本結(jié)果的準確性。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TapMan熒光定量RT-PCR檢測特異性 對于檢測甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒以及乙型流感病毒, TapMan熒光定量RT-PCR僅對乙型流感病毒呈陽性, 且反應與其他病毒無交叉。

2.2 TapMan熒光定量RT-PCR及常規(guī)RT-PCR檢測敏感度TapMan熒光定量RT-PCR相比于常規(guī)RT-PCR檢測, 對于不同濃度的乙型流感病毒敏感度更高。見表1。

表1 TapMan熒光定量RT-PCR及常規(guī)RT-PCR檢測乙型流感病毒敏感度

2.3 TapMan熒光定量RT-PCR及常規(guī)RT-PCR檢測準確率對24例送檢樣本, TapMan熒光定量RT-PCR的準確率為83.33%(20/24), 明顯高于常規(guī)RT-PCR檢測的54.17%(13/24),差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

流感病毒作為流感發(fā)生的致病體, 其有多種不同類型。甲型流感病毒是最多見的一類, 乙型流感病毒與其結(jié)構(gòu)相似,臨床表現(xiàn)接近, 但乙型流感病毒大爆發(fā)少見, 因此易誤診［6］。流感病毒的檢測有多種方法, 血清學檢測需要等到體內(nèi)病毒水平蓄積到一定程度才可發(fā)現(xiàn)。常規(guī)RT-PCR檢測是根據(jù)一段乙型流感病毒的一段, 進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增, 從而獲取特異性片段, 以此來判斷是否感染此種病毒［7］。這種方法一經(jīng)發(fā)現(xiàn), 并得到廣泛應用, 因為其相對傳統(tǒng)方法, 其特異性、敏感度以及耗時均有明顯提高。但廣泛使用中發(fā)現(xiàn)常規(guī)RTPCR檢測發(fā)生假陽性的問題較常出現(xiàn), 這主要與擴增過程中其他病毒的污染有關(guān)［8］。由于甲型流感病毒與乙型流感病毒的結(jié)構(gòu)相似, 也容易導致在檢測中出現(xiàn)假陽性。而病毒包括包膜、基質(zhì)蛋白和核心, 不同類型的病毒的主要區(qū)別在于核心的差異。病毒的遺傳物質(zhì)與核蛋白共同構(gòu)成核糖核蛋白體,而TapMan熒光定量RT-PCR就是根據(jù)乙型流感病毒核酸的特異序列作為引物, 并以5’端識別FAM, 3’端識別TAMRA作為探針, 從而避免了出現(xiàn)其他病毒如甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒檢測陽性, 即交叉反應的出現(xiàn)。同時TapMan熒光定量RT-PCR檢測, 均在完全密閉的試管內(nèi)進行, 因此其發(fā)生擴增中受污染的可能性大大降低, 從而降低發(fā)生假陽性的可能［9,10］。以上這些原因, 使得TapMan熒光定量RT-PCR相比于以前的常規(guī)RT-PCR有更好的特異性、敏感性以及準確率。同時這種方法進一步縮短了檢測乙型流感病毒的用時, 并且整個檢測過程也更加環(huán)保,不會產(chǎn)生對環(huán)境有害的物質(zhì)。

此次研究中, 熒光定量RT-PCR對乙型流感病毒核酸有較強的特異性, 反應與其他病毒之間［甲型流感病毒(H1和H3)、呼吸道合胞病毒、禽流感病毒］不存在交叉, 同時在乙型流感病毒濃度為0.01 TCID50/管的病毒效價仍有較高的敏感性。這體現(xiàn)出其檢測特異性和敏感度的優(yōu)勢。對送檢樣本,TapMan熒光定量RT-PCR相比于常規(guī)RT-PCR檢測的準確率更高 (P＜0.05)。

綜上所述, TapMan熒光定量RT-PCR是快速檢測乙型流感病毒核酸的方法, 其特異性、敏感度高, 不受其他病毒的干擾, 在咽拭子送檢樣本檢測的準確率上, 相比其他方法也有優(yōu)勢, 建議臨床進行使用。

［1］ 方巧云, 琚雄飛, 曾健君.熒光定量PCR檢測急性呼吸道感染患者常見呼吸道病毒的研究.中國預防醫(yī)學雜志, 2013,14(5):201-202.

［2］ 劉丹, 王建紅, 陳洪永.2009年-2015年唐山地區(qū)流感病毒病原學特征.中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2017, 27(2):185-187.

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［7］ 劉建榮, 宋淑娥, 何瑩, 等.實時熒光定量PCR在流感病毒核酸檢測中的應用// 公共衛(wèi)生北京論壇——甲型H1N1流感防控高層研討會, 2009:1000-1002.

［8］ 李忠, 劉倜, 張圣洋.濟南地區(qū)兒童急性呼吸道感染病原譜分析.中國公共衛(wèi)生, 2014, 30(4):520-523.

［9］ 王宇飛.G9型豬輪狀病毒TaqMan熒光定量RT--PCR檢測方法的建立及初步應用.東北農(nóng)業(yè)大學, 2016.

［10］ 盧亦愚, 嚴菊英, 馮燕, 等.熒光定量RT-PCR快速檢測乙型流感病毒核酸.浙江預防醫(yī)學, 2005, 17(3):1-3.