徐海東 ，伍時華 ，易 弋 ，黃翠姬 ，趙東玲

（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006；2.廣西科技大學(xué)廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006；3.廣西科技大學(xué)廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州545006）

從20世紀(jì)70年代石油危機(jī)爆發(fā)以后，石油、天然氣等不可再生能源的日益耗竭，使得燃料乙醇這一清潔能源成為了可再生資源的發(fā)展重點。乙醇不僅能作為一種優(yōu)良的燃料，還可以作為一種優(yōu)良的燃油品改善劑，使得汽油燃燒更加充分，能有效地降低一氧化碳等有害氣體的排放，從而達(dá)到節(jié)能、環(huán)保的目的。因乙醇具有清潔、環(huán)保、安全、可再生等較多優(yōu)點，已在歐美和巴西等發(fā)達(dá)國家得到廣泛的應(yīng)用[1]。但乙醇的發(fā)酵過程的生產(chǎn)成本高依舊是阻礙乙醇作為一種清潔燃料廣泛使用的障礙之一，因此，利用廉價的甘蔗糖蜜生產(chǎn)燃料乙醇有著重要意義[2]。

甘蔗糖蜜又稱糖漿，是制糖工業(yè)將壓榨出的甘蔗汁液，經(jīng)加熱、中和、沉淀、過濾、濃縮、結(jié)晶等工序制糖后所剩下的濃稠液體，是糖廠的副產(chǎn)品之一。甘蔗糖蜜成分復(fù)雜，包括蛋白質(zhì)、維生素、有機(jī)酸和一些金屬離子，且含糖量很高，一般占到30%～50%，是發(fā)酵、飼料、食品和建筑行業(yè)中常見原料，但其中還混有大量的非糖成分和雜質(zhì)[3]，如含有5%～10%的膠體物質(zhì)（主要由果膠質(zhì)、焦糖和黑色素等組成），這是乙醇發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量泡沫的主要原因，會降低發(fā)酵效率[4-5]，色素、重金屬和糠醛等物質(zhì)也會對酵母的生長繁殖產(chǎn)生不利的影響，這對于酵母利用甘蔗糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)乙醇是非常不利的。目前，我國甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵的醪液乙醇含量仍然較低，一般為7%vol～8%vol[6-7]，所以，采取有效的方法對甘蔗糖蜜進(jìn)行預(yù)處理，對提高甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵的醪液乙醇含量是很有必要的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GJ2008，廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏。

甘蔗糖蜜：取自廣西露塘糖廠。

斜面活化培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH值，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

一級種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH值，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

二級種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH值，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糖蜜經(jīng)過預(yù)處理后，稀釋至總糖濃度為260 g/L，115℃高壓蒸汽滅菌30 min后每100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基加入過濾除菌的1 mL尿素溶液（400 g/L）。

儀器設(shè)備：ZWYD-2402疊式恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SBA-40X三通道生物傳感儀和SGD-IV全自動還原糖測定儀，山東科學(xué)院生物研究所；Mikro220R臺式冷凍離心機(jī)，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；高效液相色譜儀，株式會社日立制作所。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法

將菌種GJ2008經(jīng)30℃斜面活化1 d后，分別接種至一級種子培養(yǎng)基中，以32℃、160 r/min搖床培養(yǎng)12 h，以10%的接種量轉(zhuǎn)接至二級種子培養(yǎng)基中，以32℃、160 r/min搖床培養(yǎng)10 h后，4000 r/min離心10 min，棄上清液得酵母泥，加入無菌水振蕩混合制得10倍濃縮種子懸液。

1.2.2 甘蔗糖蜜的預(yù)處理

（1）無處理（對照組）。甘蔗糖蜜1∶1用蒸餾水稀釋后，離心，收集上清液待用。

（2）煮沸處理。甘蔗糖蜜1∶1用蒸餾水稀釋后，加熱煮沸30 min，離心，收集上清液待用。

（3）活性炭處理。甘蔗糖蜜1∶1用蒸餾水稀釋后，加入1%活性炭粉末吸附處理，離心，收集上清液待用。

（4）磷酸鈣處理。甘蔗糖蜜1∶1用蒸餾水稀釋后，按照8 g/100 mL加入磷酸鈣在20℃不斷攪拌4 h，離心，收集上清液待用。

（5）亞鐵氰化鉀處理。甘蔗糖蜜1∶1用蒸餾水稀釋后，加入0.1%亞鐵氰化鉀，調(diào)節(jié)至pH5.5，煮沸30 min，同時加入1%活性炭，離心，收集上清液待用。

（6）硫酸處理。甘蔗糖蜜1∶1用蒸餾水稀釋后，加熱煮沸，冷卻后加濃硫酸至pH1.0～2.0，靜置過夜，離心，上清液調(diào)至pH5.5左右，90℃保溫30 min，加入1%活性炭，離心，收集上清液待用。

（7）聯(lián)合處理。甘蔗糖蜜1∶1用蒸餾水稀釋后，加熱煮沸，冷卻后加濃硫酸至pH1.0～2.0，90℃保溫30 min后靜置過夜，離心，上清液調(diào)至pH5.5左右，加入1%活性炭，離心，上清液加入1%亞鐵氰化鉀，調(diào)節(jié)至pH5.5，同時按照8 g/100 mL濃度加入磷酸鈣后在20℃下不斷攪拌4 h，離心，上清液供試驗。

1.2.3 酒精發(fā)酵方法

將2 mL的10倍濃縮種子液分別接種至裝液量200 mL和500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，以32℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，透氣膜封口后用牛皮紙包扎封口進(jìn)行微通氧發(fā)酵，每組3個平行試驗，發(fā)酵開始0 h、3 h、6 h以后每隔6 h取樣并測CO2失重，失重小于0.2 g時發(fā)酵結(jié)束。

1.2.4 分析測定方法

1.2.4.1 乙醇測定

采用生物傳感分析儀測定，標(biāo)準(zhǔn)乙醇為400mg/L。

1.2.4.2 殘總糖的測定

稀硫酸酸解后，稀釋合適倍數(shù)，用全自動還原糖測定儀測定。

1.2.4.3 葡萄糖、果糖、蔗糖測定

采用高效液相色譜儀測定。氨基柱規(guī)格：250×4.6 mm，5 μm；流動相為乙腈：二次水（v/v）=80∶20，流速1.0 mL/min，柱溫35℃；蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）參數(shù)：漂移管溫度80℃，空氣流速2.0 L/min。

1.2.5 計算方法

2 結(jié)果與討論

2.1 不同預(yù)處理的甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程糖代謝分析(圖1、圖2、圖3、圖4、圖5)

用不同預(yù)處理的甘蔗糖蜜進(jìn)行乙醇發(fā)酵，結(jié)果見圖1。在初總糖濃度相同時，殘?zhí)橇吭礁邉t說明糖消耗越慢，殘?zhí)橇吭降驼f明糖消耗越快[8]。發(fā)酵結(jié)束時，聯(lián)合處理組的殘總糖量最低（30 g/L），遠(yuǎn)低于殘?zhí)橇孔罡叩臒o處理（63.14 g/L），且其他預(yù)處理方式的最終殘?zhí)蔷∮趯φ战M，結(jié)果表明，經(jīng)過處理后的甘蔗糖蜜在不同程度上均有利于酵母細(xì)胞對糖的消耗。

圖1 不同預(yù)處理甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵殘總糖代謝曲線

如圖2、圖3、圖4所示，由于硫酸酸化使得硫酸處理組與聯(lián)合處理組蔗糖發(fā)生水解，0 h蔗糖濃度明顯低于其他各組，而葡萄糖和果糖的濃度高于其他組。發(fā)酵開始后，各組的蔗糖在轉(zhuǎn)化酶的作用下濃度一直降低，葡萄糖和果糖濃度先升高，然后由于酵母的代謝使糖濃度迅速下降。在發(fā)酵結(jié)束時（66 h），葡萄糖和蔗糖基本上被完全耗盡，其殘?zhí)侵饕獮楣?，因為對于酵母?xì)胞而言，果糖的利用速率遠(yuǎn)小于葡萄糖[14]。無處理、煮沸處理、活性炭處理、磷酸鈣處理、亞鐵氰化鉀處理、硫酸處理、聯(lián)合處理的果糖濃度分別是57.8 g/L、50.2 g/L、49.1 g/L、46.4 g/L、44.8 g/L、36.5 g/L、29.7 g/L；對照組的果糖濃度明顯高于其他組。

圖2 不同預(yù)處理甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程蔗糖代謝曲線

糖消耗速率可以定量地表示單位時間內(nèi)糖消耗的快慢[9]。由圖5所示，總糖消耗速率呈現(xiàn)了先增大后減小的趨勢，且在12～18 h時，各組的總糖消耗速率均達(dá)到最大值，無處理、煮沸處理、活性炭處理、磷酸鈣處理、亞鐵氰化鉀處理、硫酸處理、聯(lián)合處理的總糖消耗速率分別為7.01 g/L·h、7.42 g/L·h、7.57 g/L·h、7.72 g/L·h、7.43 g/L·h、7.78 g/L·h、8.03 g/L·h；且大多數(shù)時間段內(nèi)各實驗組的總糖消耗速率均大于對照組。結(jié)果表明，經(jīng)以上方法對蔗糖糖蜜預(yù)處理后，加快了酵母對糖的消耗速率。

圖3 不同預(yù)處理甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程葡萄糖代謝曲線

圖4 不同預(yù)處理甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程果糖代謝曲線

2.2 不同預(yù)處理的甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程乙醇生成分析(圖6、圖7)

如圖6所示，不同預(yù)處理方法的甘蔗糖蜜發(fā)酵過程中，酵母細(xì)胞的乙醇生成趨勢基本是一致的。與對照組（82.45 g/L）相比，試驗組的乙醇濃度均高于對照組，其中聯(lián)合處理的最終乙醇濃度最高，達(dá)到100.99 g/L。乙醇的生成與酵母利用糖的多少有著密切的關(guān)系[9]，比較圖5和圖7可知，總糖消耗速率與乙醇生成速率的總體趨勢基本一致，3～48 h乙醇生成速率較大，最大值出現(xiàn)在12～18 h，無處理、煮沸處理、活性炭處理、磷酸鈣處理、亞鐵氰化鉀處理、硫酸處理、聯(lián)合處理的乙醇濃度分別為3.25 g/L·h、3.33 g/L·h、3.52 g/L·h、3.42 g/L·h、3.42 g/L·h、3.62 g/L·h、3.77 g/L·h；在3～48 h發(fā)酵階段，各試驗組的乙醇生成速率均大于對照組。結(jié)果表明，甘蔗糖蜜預(yù)處理后，酵母生成乙醇的速率加快，最終乙醇濃度升高。

圖5 不同預(yù)處理的甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程總糖消耗速率

圖6 不同預(yù)處理的甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程乙醇生成曲線

2.3 不同預(yù)處理的甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵參數(shù)分析

甘蔗糖蜜在不同預(yù)處理的條件下，酵母的乙醇發(fā)酵參數(shù)見表1。在初總糖基本相同的情況下，發(fā)酵結(jié)束時，無處理、煮沸處理、活性炭處理、磷酸鈣處理、亞鐵氰化鉀處理、硫酸處理、聯(lián)合處理的總糖濃度分別為63.14 g/L、54.95 g/L、53.8 g/L、50.9 g/L、49.1 g/L、39.18 g/L、30 g/L，與對照組相比，發(fā)酵結(jié)束時各實驗組的殘總糖均有所降低，其中殘總糖最低的聯(lián)合處理組殘總糖下降了52.48%。而預(yù)處理對酵母細(xì)胞的發(fā)酵時間并無明顯影響。與對照組相比，各試驗組的最終乙醇濃度均有所提高，最高的聯(lián)合處理組的乙醇濃度提高了22.48%，總糖發(fā)酵效率和耗糖發(fā)酵效率均有所增大。

表1 不同預(yù)處理條件下酵母GJ2008甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵參數(shù)

圖7 不同預(yù)處理的甘蔗糖蜜乙醇發(fā)酵過程乙醇生成速率

3 結(jié)論

甘蔗糖蜜中糖類物質(zhì)及其他營養(yǎng)物質(zhì)是酵母乙醇發(fā)酵的主要原料[10]。但其中也含有一些抑制酵母生長的不利因素。如果膠質(zhì)、焦糖、黑色素組成的膠體物質(zhì)，會吸附在酵母細(xì)胞上從而抑制細(xì)胞的生長，同時還會在乙醇發(fā)酵時產(chǎn)生大量氣泡，影響發(fā)酵效率[11]。金屬離子對乙醇生成的影響比較復(fù)雜，根據(jù)Chotineeranat等[12]的研究，當(dāng)鈣離子濃度為2.16%（w/v），蔗糖乙醇發(fā)酵機(jī)制被完全抑制。所以說甘蔗糖蜜需要經(jīng)過預(yù)處理，去除影響酵母生長發(fā)酵的物質(zhì)，才能更好地生成乙醇。

本實驗利用煮沸、磷酸鈣、亞鐵氰化鉀、聯(lián)合處理等方法對甘蔗糖蜜進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行乙醇發(fā)酵，以糖消耗速率、乙醇生成速率和總糖發(fā)酵效率等指標(biāo)進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理是一種比較適宜的預(yù)處理方法，硫酸能在有效除去甘蔗糖蜜中影響酵母細(xì)胞生長發(fā)酵的膠體物質(zhì)同時，也能酸解一定的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖，亞鐵氰化鉀可以去除甘蔗糖蜜中的鐵離子等金屬離子。最終發(fā)酵結(jié)束時，殘總糖濃度、乙醇濃度、乙醇生成速率分別為30 g/L、100.99 g/L和1.68 g/L·h。與無處理相比，殘總糖降低了52.48%，最終乙醇濃度提高了22.48%，乙醇生成速率提高了22.62%。雖然本實驗得到的乙醇濃度并不是最高的，但與其他發(fā)酵原料相比，甘蔗糖蜜具有成本低、來源廣等優(yōu)點，有較好的發(fā)展前景。

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