（1重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院檢驗科 重慶 400000）（2第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院病理科 重慶 400042）

EGFR基因位于第七號染色體短臂上（7p12），長約118 kb，由28個外顯子組成。其編碼的蛋白具有酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TK）活性，是NSCLC最常見的驅動基因，據統(tǒng)計，中國NSCLC患者中EGFR突變率約為35%～40%[1]。EGFR誘導癌癥至少通過3種機制：EGFR配體的過表達、EGFR的擴增或EGFR的突變活化，其中以EGFR 的突變活化為主要機制。已經檢測到的突變數量最多的是非小細胞肺癌[2-3]。測序法是傳統(tǒng)廣泛應用的方法，在檢測EGFR突變中使用較多，但由于其靈敏度有限、檢測過程時間長，對技術設備條件要求嚴格等，在臨床應用受到一定限制。而ARMS法由于其靈敏度較高、耗時少、易操作等特點，在各種標本類型中甚至在外周血循環(huán)腫瘤細胞DNA中檢測EGFR突變也有一定的意義。因此本文通過ARMS法和直接測序法兩種檢測的對比，來選擇更加敏感，準確的EGFR基因檢測方法。

1.資料與方法

1.1 標本來源

對2012年7月—2013年11月在第三軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院病理科接受EGFR突變檢測的NSCLC病人標本進行研究，其中非小細胞肺癌的患者127例，其中：男性76例、女性51例、年齡26～83歲，平均年齡54.5歲。

1.2 儀器與試劑

ARMS試劑盒內含內參基因特異性引物，探針，EGFR基因突變型，內控基因特異性引物，dNTP的溶液，TaqDNA聚合酶，陽性質控品，PCR管，熒光PCR管。

1.3 檢測步驟

待測樣本進行DNA提取后，使用微量紫外分光光度計(NanoDrop1000)測定DNA濃度及純度，取10ulDNA樣本稀釋至100ng∕ul待用。將純化后的DNA用熒光PCR方法進行檢測，得到突變基因的反應曲線。測序法則上測序儀進行檢測，結果與EGFR序列進行比對。

1.4 實驗結果成功與否判定

NC1-7管的FAM信號應該無曲線升起，PC應有擴增（成典型的S型曲線），切Ct值≦28，則可繼續(xù)分析；若內參基因（IR）有擴增且19≤Ct值≤25，則可繼續(xù)分析；若Ct值較小，則可認為DNA樣品濃度過高；若其Ct值較大或無擴增，則認為DNA樣品濃度過低、發(fā)生降解，或含有PCR抑制劑。若內控基因檢測（HEX通道）有擴增且Ct≤25，則可繼續(xù)分析；若其Ct值較大或無擴增，但突變位點檢測（FAM通道）有擴增且Ct值≤38，則可繼續(xù)分析；若其Ct值較大或無擴增，而突變位點檢測（FAM通道）無擴增或有擴增但Ct值＞38，則無法繼續(xù)分析；若樣品中某基因突變位點檢測（FAM通道）有擴增且Ct值≤35，則判定該樣本突變結果陽性；若Ct值＞38或無擴增，則判定該突變結果為陰性；若35＜Ct值≤38，可重復實驗，若Ct值仍在此范圍內，則判定該樣本突變結果為疑似陽性（可能由于突變含量低造成Ct值波動）。而測序法測出的DNA序列則直接與EGFR基因序列進行比對。

1.5 統(tǒng)計學處理

由于是兩個率的比較，且又符合四格表資料的卡方檢驗條件（樣本含量）40，理論頻數不小于5），故采用四格表資料的卡方檢驗來比較兩個率的差別是否具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.結果

2.1 在127例兩種檢測的病人中，兩種方法均檢測到突變29例，均無突變者63例，AMRS法檢測出而測序法未測出者31例，反之4例。

表 ARMS法和測序法檢測結果四格表

根據上述四格表的分析，通過對計數資料的kappa一致性檢驗，得出兩種方法有一定的一致性（k=0.53，P＜0.05）。綜合兩種方法，最終確定有突變的患者為64例，ARMS法檢出60例，敏感性為93.75%，測序法檢出33例，敏感性為51.56%。ARMS法的檢測突變率為47.2%，而直接測序法檢測突變率為26.0%，通過四格表資料卡方檢驗對兩種方法檢出突變率的比較，ARMS法的突變檢出率要明顯高于測序法（P＜0.05）。

2.2 兩種檢測方法結果

在127例檢測標本中，ARMS共檢測到60例突變，突變率為47.2%，有34例21外顯子突變（其中32例L858R突變，2個L861Q替換）,占所有突變的56.7%，23例19外顯子缺失突變，占所有突變的38.3%，2例18外顯子G719C突變，1例20外顯子插入突變；直接測序法共檢測出33例突變，突變率為26%，其中13例21外顯子點突變，17例19外顯子缺失突變，2例20外顯子插入突變，1例18外顯子點突變。

3.討論

非小細胞肺癌（NSCLC）是一種嚴重危害人類健康的常見的惡性腫瘤，表皮生長因子受體（EGFR）的基因突變狀態(tài)是預測表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）療效的重要指標，所以尋求一個靈敏，快速，準確的檢測EGFR基因突變方法是必要的。

測序法是指分析特定DNA片段的堿基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤的（G）排列方式，目的是確定重組DNA的方向與結構對突變進行定位和鑒定比較研究，是檢測基因突變的金標準。PCR結果判斷標準是根據測序峰中是否出現了突變波，其高低影響結果的判斷。當突變的腫瘤細胞含量少，導致突變峰低或不能測出時，測序法就可能會出現假陰性的結果。ARMS法由于只擴增突變序列，所以靈敏度會提高，但由于只能測出包含在試劑盒里的已知突變位點，故假陰性也會發(fā)生。

測序法需特殊且昂貴設備，條件要求高，反應耗時長（每檢測一批樣本，前后總耗時超過3天），且存在著操作繁瑣，對標本所含腫瘤組織的要求比較高，敏感性不低于30%突變拷貝數。[10]判讀結果復雜，對環(huán)境和操作者有危害等諸多缺點，因而該方法僅適用于少數技術裝備精良的實驗室開展，各級醫(yī)院很少能獨立開展，使得其運用受限。而ARMS法是實時熒光定量PCR的一種，具有較高的靈敏度。趙婧雅等[11]的研究表明，對于活檢小標本而言ARMS法較直接測序法擁有更高的突變檢出率；而對于手術標本無統(tǒng)計學差異由檢測結果得知，最終確定有突變的患者為64例，ARMS法檢出60例，敏感性為93.75%，測序法檢出33例，敏感性為51.56%。ARMS法的檢測突變率為47.2%，而直接測序法檢測突變率為26.0%。通過四格表資料卡方檢驗對兩種方法檢出突變率的比較，ARMS法的突變檢出率要明顯高于測序法（P＜0.05）。

綜上所述，ARMS法比測序法有更高的靈敏度和突變檢出率，而且ARMS法簡單、快速，適合在臨床推廣。

[1]劉標，周曉軍.非小細胞肺癌個體化治療的靶向分子檢測[J].臨床與實驗病理學雜志，2012,28（8）；831-7.

[2]宿杰阿克蘇，候英勇，等.PCR直接測序法與ARMS檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變[J].臨床與實驗病理學雜志，2014,30（3）：331.

[3]王向迎，劉友如，牛艷潔，等.非小細胞肺癌EGFR基因突變檢測技術進展[J].國際呼吸雜志，2012,32（10）：797.