劉 螢, 張 蓉, 崔鳳云, 韓 深

(北京出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心, 北京 100026)

肉桂醛(cinnamaldehyde)也稱為桂醛,為無色至淡黃色黏稠狀液體,具有強烈的肉桂氣味,大量存在于肉桂等植物體內(nèi)[1,2],自然界中天然存在的肉桂醛均為反式結(jié)構(gòu)。肉桂醛可作為水果防腐劑[3,4],并可在食品中作為香料、調(diào)料以改善口感風(fēng)味。美國香料生產(chǎn)者協(xié)會(FEMA)對肉桂醛的安全性進行了系統(tǒng)評價[5],認為其作為食品添加劑沒有安全風(fēng)險,在冷飲、肉類及膠姆糖中的推薦使用量為7.7～4 900 mg/kg[6]。中國、美國和日本已將肉桂醛應(yīng)用于食品和食品包裝中,利用其殺菌、消毒、防腐的功能延長食品的保質(zhì)期[7-10]。我國食品安全國家標準《食品添加劑使用標準》[11]中規(guī)定肉桂醛作為防腐劑可在經(jīng)表面處理的鮮水果中使用,最大使用量按照生產(chǎn)需要適量添加,殘留量應(yīng)≤0.3 mg/kg。

目前檢測肉桂醛殘留量方法的報道較少,且現(xiàn)有方法均針對肉桂醛含量較高的調(diào)味品[12]、中藥[13,14]和飼料[15]等,檢測含量均大于100 mg/kg。我國藥典[16]規(guī)定采用高效液相色譜法測定肉桂醛;我國食品安全國家標準《食品添加劑肉桂醛》[17]中規(guī)定肉桂醛作為食品添加劑時,以氣相色譜法作為其有效成分的檢測方法,但并不適用于食品中該物質(zhì)的檢測。其他文獻報道的檢測方法有紫外分光光度計法[18,19]、液相色譜法[20,21]、氣相色譜法[22,23]、氣相色譜-質(zhì)譜法[24]等,前3種方法更適用于較高含量的肉桂醛檢測;氣相色譜-質(zhì)譜法靈敏度更高,并且可以借助譜庫對目標化合物準確定性。糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)也沒有肉桂醛的檢測標準。

本研究選取水果和鮮肉基質(zhì),利用改良的QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜,建立了快速、準確檢測食品中肉桂醛殘留的定性定量分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)(美國Thermo公司),包括Trace 1310氣相色譜系統(tǒng)、ISQ LT質(zhì)譜檢測器、Xcalibur工作站;高速離心機(美國Sigma公司); ZKXT-5600高速均質(zhì)機(北京中科光大公司); Milli-Q凈化器(美國Millipore公司)。

N-丙基乙二胺(PSA)(40～60 μm)、石墨化炭黑(GCB)(120～400 μm)和C18吸附劑(50 μm);乙腈、乙酸乙酯、甲苯為色譜純(美國Fisher公司);肉桂醛標準品(純度≥99%, CAS No.: 104-55-2,美國AccuStandard公司);亞鐵氰化鉀、乙酸鋅為分析純。實驗用水為經(jīng)Milli-Q凈化系統(tǒng)過濾的高純水。水果及鮮肉樣品均購自北京某超市。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取10 mg肉桂醛標準品(精確至0.01 mg),用乙腈溶解,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備液溶液。準確吸取肉桂醛標準儲備液1 mL,置于50 mL容量瓶中,用乙酸乙酯定容,配制1 mg/L的肉桂醛標準中間液。

準確吸取肉桂醛標準中間液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和5.0 mL,用乙酸乙酯定容至10 mL,配制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5 mg/L的標準工作溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

1.3.1提取

新鮮水果:稱取試樣5 g(精確到0.01 g),置于50 mL離心管中,加入10 mL乙酸乙酯,以10 000 r/min均質(zhì)提取1 min,然后以8 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移出上層乙酸乙酯提取液,用乙酸乙酯定容至10 mL,待凈化。

鮮肉:稱取試樣5 g(精確到0.01 g),置于50 mL離心管中,加入10 mL水,漩渦混勻,加入2 mL鐵氰化鉀溶液(92 g/L)和2 mL乙酸鋅溶液(183 g/L),漩渦混勻,然后加入20 mL乙酸乙酯,以10 000 r/min均質(zhì)提取1 min,以8 000 r/min離心5 min,轉(zhuǎn)移出上層乙酸乙酯提取液,用乙酸乙酯定容至20 mL,待凈化。

1.3.2凈化

新鮮水果:分別稱量50 mg PSA、10 mg GCB和10 μL甲苯,置于2 mL具塞離心管中,加入1 mL提取液,渦旋振蕩1 min,靜置5 min,過針筒式濾膜,待分析。

鮮肉:分別稱量50 mg PSA、10 mg GCB和100 mg C18,加入10 μL甲苯,置于2 mL具塞離心管中,加入1 mL提取液,渦旋振蕩1 min,靜置5 min,過針筒式濾膜,待分析。

1.4 分析條件

色譜柱:DB-5 MS石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進樣口溫度:250 ℃;載氣:氦氣,純度≥99.999%;流速:1.2 mL/min。程序升溫:初始溫度40 ℃,保持1 min;以15 ℃/min的速率升至180 ℃,保持1 min;以50 ℃/min的速率升至300 ℃,保持3 min。進樣量:1 μL;進樣方式:不分流進樣;開閥時間:1.5 min。

離子源:EI源;掃描方式:選擇離子監(jiān)測方式;離子源溫度:280 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;電離能量:70 eV;溶劑延遲:5 min。

肉桂醛的保留時間為8.86 min,定量離子為131.1,定性離子分別為103.1、77.1和51.1。4種離子的相對豐度比為100∶67∶62∶45。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的選擇

肉桂醛的共軛苯環(huán)結(jié)構(gòu)在290 nm處有最大吸收波長,可以通過液相色譜-二極管陣列檢測器進行測定,同時肉桂醛具有揮發(fā)性,也可通過氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜進行檢測。采用以上3種方式對肉桂醛標準溶液(200 mg/L)進行分析,結(jié)果顯示,采用氣相色譜-質(zhì)譜時,肉桂醛的靈敏度最高(S/N=600),其次是液相色譜(S/N=85)和氣相色譜(S/N=20)。但肉桂醛的相對分子質(zhì)量較小,使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測時,產(chǎn)生的分子離子碎片較小,容易受到雜質(zhì)干擾,因此實驗嘗試采用液相色譜法,通過加入鹽酸羥胺或2,4-硝基苯肼的方式進行衍生[25,26],但反應(yīng)均產(chǎn)生2個以上衍生物,無法定量測定。同時實驗還發(fā)現(xiàn)肉桂醛性質(zhì)活潑且易揮發(fā),使用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮氣濃縮手段均有很大損失。因此最終選擇最靈敏的氣相色譜-質(zhì)譜進行檢測。肉桂醛標準溶液(10 mg/L)的色譜圖和質(zhì)譜圖見圖1。

圖 1 肉桂醛標準溶液(10 mg/L)的色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 1 Chromatogram and mass spectrum of cinnamaldehyde standard solution (10 mg/L)

圖 2 提取溶液和提取方式對肉桂醛回收率的影響Fig. 2 Effects of extraction solvents and extraction modes on the recoveries of cinnamaldehyde

2.2 溶解液的選擇

肉桂醛易溶于甲醇、乙醇和乙醚?？紤]到乙醚揮發(fā)性較強,因此實驗分別選用甲醇和乙腈作為溶解液配制標準溶液。將甲醇和乙腈配制的標準溶液(10 mg/L)在室溫下避光放置1周,采用氣相色譜-質(zhì)譜進行分析,掃描范圍為m/z0～300。結(jié)果表明,采用甲醇時,色譜圖出現(xiàn)雙峰,經(jīng)與譜庫比對,推測其中一個為肉桂醛的分解產(chǎn)物;采用乙腈時,沒有發(fā)現(xiàn)分解產(chǎn)物的色譜峰。因此選擇乙腈作為配制標準溶液的溶解液。

2.3 提取方法的優(yōu)化

經(jīng)查閱文獻,報道較多的3種提取試劑分別為甲醇[16]、乙醇[12,19]和乙酸乙酯[22,27]。常用的提取方式為超聲(30 min)和均質(zhì)(1 min)。實驗分別采用以上3種提取試劑并結(jié)合超聲和均質(zhì)兩種提取方式對加標蘋果樣品進行分析。結(jié)果表明,采用甲醇和乙酸乙酯提取試劑并結(jié)合均質(zhì)提取時肉桂醛的回收率最高,可達90%～105%(見圖2)。而乙酸乙酯可作為非極性石英毛細管柱的進樣溶劑,凈化后無需格外的濃縮步驟,避免了濃縮對目標化合物的損失。因此實驗最終選擇乙酸乙酯作為提取試劑。

新鮮水果的含水量較高,經(jīng)預(yù)處理后成漿狀,在均質(zhì)過程中可以在乙酸乙酯提取液中很好地分散,高速離心后,乙酸乙酯層和水層明顯分層,沒有乳化現(xiàn)象發(fā)生,提取液可進一步凈化。

由于鮮肉黏度較高,對鮮肉進行提取前需加入10 mL水分散基質(zhì),然后對應(yīng)添加20 mL乙酸乙酯進行提取。鮮肉中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高,均質(zhì)過程中水層和乙酸乙酯層發(fā)生了乳化,因此需要去除多余的蛋白質(zhì)。實驗選取乙酸鋅溶液(2 mL, 183 g/L)和亞鐵氰化鉀溶液(2 mL, 92 g/L)作為蛋白質(zhì)沉淀劑,以防止乳化現(xiàn)象的發(fā)生。加入蛋白質(zhì)沉淀劑后,乙酸乙酯層與水層界線清晰,肉桂醛的回收率在90%以上。

2.4 濃縮方法的考察

將1 mL 0.5 mg/L和1 mL 10 mg/L的肉桂醛標準溶液分別加入10 mL甲醇、乙醇、乙腈和乙酸乙酯等4種不同溶劑中,在40 ℃和室溫(25～30 ℃)條件下對溶劑進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮和氮氣濃縮。結(jié)果表明,在室溫條件下,無論旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)還是氮氣濃縮,均會損失60%以上的目標化合物,且前處理過程需耗時1 h。40 ℃條件下濃縮可以縮短溶劑揮發(fā)的時間,但損失率高達95%。因此肉桂醛含量較低的樣品無法采用常規(guī)的濃縮手段,只能通過選擇高靈敏度的儀器達到檢測目的。

2.5 凈化方法的優(yōu)化

2.5.1水果

水果的主要成分有水分、糖分、有機酸和色素,通過外標法直接進樣,回收率超過200%,基質(zhì)增強效應(yīng)較為明顯,且直接對樣品進行分析會對儀器系統(tǒng)造成較大污染,因此需要對樣品進行凈化。實驗根據(jù)文獻[28-31]考察了PSA和GCB的使用量,以及添加甲苯與否對肉桂醛回收率的影響。

采用正交試驗對3個影響提取效率的因素進行考察,具體方案和結(jié)果見表1。結(jié)果表明,影響肉桂醛回收率因素的主次順序是PSA>GCB>甲苯,最優(yōu)的凈化劑組合是50 mg PSA、10 mg GCB和10 μL甲苯。以加標葡萄樣品(0.3 mg/kg)為例,其凈化前后的色譜圖見圖3?？梢钥闯?凈化后目標化合物附近的雜峰變少,且回收率為103%,基質(zhì)增強效應(yīng)明顯得到了抑制。

2.5.2鮮肉

肉類的主要成分有水、蛋白質(zhì)和脂肪,同時含有無機鹽和少量色素。對未經(jīng)凈化的豬肉提取液上機測定,目標化合物周圍沒有干擾峰,但基線水平較高,基質(zhì)增強作用明顯,因此需要凈化。樣品均質(zhì)提取后,可通過離心將蛋白質(zhì)和水分有效去除,但是仍有部分脂肪無法去除。因此在凈化水果樣品的基礎(chǔ)上,分別考察了不同劑量(0、50、100和200 mg)的C18固相吸附劑對凈化效果的影響。結(jié)果表明,加入100 mg和200 mg C18固相吸附劑時的凈化效果基本相同。因此對鮮肉樣品進行凈化時,在凈化水果步驟的基礎(chǔ)上,添加100 mg C18固相吸附劑。

表 1 正交試驗方案及結(jié)果

K: the sum of the test results;k: the average of the test results; /: no data.

圖 3 凈化(a)前、(b)后加標葡萄樣品(0.3 mg/kg)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of spiked grape samples (a) before and (b) after purification

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1線性范圍

對肉桂醛標準工作液進行測定,以肉桂醛的濃度為橫坐標(x, mg/L),相應(yīng)峰面積為縱坐標(y)繪制標準曲線,其線性方程為y=1.82×104x-9.66×104,在0.01～0.5 mg/L范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)>0.999。

2.6.2定量限

為考察方法的定量限是否滿足SN/T 0001-2014標準的要求,分別向凈化后的空白櫻桃和豬肉樣品中添加肉桂醛標準溶液,使其達到預(yù)計的定量限水平0.05 mg/kg和0.1 mg/kg。在氣相色譜-質(zhì)譜上進行檢測,計算得到空白櫻桃和豬肉樣品中肉桂醛的信噪比(S/N)分別為73和23,高于10倍信噪比,滿足定量限低于我國食品安全國家標準《食品添加劑使用標準》中規(guī)定的水果中肉桂醛限量值(0.3 mg/kg)的1/3的檢測要求。

2.6.3準確度和精密度

根據(jù)SN/T 0001-2014標準中方法驗證的要求,對橙子、蘋果、桃、藍莓、葡萄、荔枝、芒果、香蕉和西瓜等9種新鮮水果基質(zhì)進行0.05、0.3和0.6 mg/kg 3個水平的加標回收試驗,每個水平重復(fù)6次。結(jié)果表明,肉桂醛的回收率為80.0%～108.8%,精密度≤8.6%(見表2)。

對豬肉、牛肉和羊肉3種新鮮肉類進行定量限、2倍定量限和10倍定量限的加標回收試驗。結(jié)果表明,鮮肉樣品中肉桂醛的回收率為81.9%～104.5%,精密度≤7.1%(見表2)。

表 2 不同樣品中肉桂醛的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

2.7 穩(wěn)定性

2.7.1標準溶液

分別配制100 mg/L和10 mg/L的肉桂醛標準溶液,于-20 ℃、4 ℃和室溫下進行避光和不避光保存,在第1、2、4、8、12、20和24周對其進行測定,每次測定2個平行溶液,考察標準溶液的穩(wěn)定性。

結(jié)果表明,10 mg/L的標準溶液在所有條件下均可穩(wěn)定保存2周;在-20 ℃和4 ℃避光條件下可穩(wěn)定保存8周。100 mg/L標準溶液在所有條件下均可穩(wěn)定保存12周。

2.7.2試樣溶液

按1.3節(jié)描述對加標蘋果樣品(0.3 mg/kg)進行提取和凈化,凈化液平均分成5份,于4 ℃避光保存,每天取樣1份,連續(xù)測定5 d。結(jié)果表明,肉桂醛在第3 d開始出現(xiàn)明顯衰減(剩余59.8%的目標物),第5 d全部衰減。因此為保證結(jié)果的準確性,試樣溶液需在24 h內(nèi)測定。

2.8 實際樣品檢測

除對加標回收試驗的9種水果和3種鮮肉樣品進行實際檢測外,還對樹莓、哈密瓜、菠蘿、梨、李子、木瓜、火龍果、獼猴桃和鮮雞肉等9種典型基質(zhì)進行檢測。結(jié)果表明,1個芒果樣品和1個樹莓樣品中檢出肉桂醛，含量分別為0.068 mg/kg和0.063 mg/kg,其余樣品中肉桂醛含量均小于定量限。

3 結(jié)論

本文采用改良的QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合GC-MS,建立了食品中肉桂醛殘留量的快速測定和確認方法。該法適用于水果及肉類中肉桂醛的測定,填補了食品中低含量肉桂醛測定方法的空白。該方法靈敏度高,重復(fù)性好,且具有穩(wěn)定的回收率,能夠滿足GB 2760-2014標準規(guī)定的水果中肉桂醛限量的測定要求,也為鮮肉中肉桂醛限量的設(shè)定建立前期風(fēng)險監(jiān)控檢測基礎(chǔ)。

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