李 雙, 陳樹兵, 李露青, 徐旭文,陳先鋒, 鐘鶯鶯, 張雅珩, 王傳現(xiàn)

(1. 寧波出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波大學應用海洋生物技術教育部重點實驗室, 浙江 寧波 315211; 3. 甘肅出入境檢驗檢疫局綜合技術中心, 甘肅 蘭州 730010; 4. 上海出入境檢驗檢疫局, 上海 200135)

禁限用獸藥超量和超種類的濫用是目前食品安全所面對的重大問題之一。近年來,由于養(yǎng)殖條件差異和利益驅使,獸藥超標現(xiàn)象時有發(fā)生,激素類殘留非常普遍,陽性樣品檢出率逐年攀升[1,2]。原料雞養(yǎng)殖過程中所用抗生素種類繁多,甚至抗生素停藥期不停用,使用國家禁用的地塞米松類藥物[3]。目前,我國獸藥殘留檢測的標準多達數(shù)十個,多是按照某一類獸藥建立的,且適應食品基質單一[4-7]。因此,建立食品中多獸藥的高通量篩查方法,對提高監(jiān)管工作效率、保障食品安全具有重要的意義。

獸藥檢測主要涉及兩方面技術:前處理技術和儀器分析。常見的前處理技術包括固相萃取、固相微萃取、基質分散固相萃取、免疫親和色譜技術、分子印跡技術、超臨界流體萃取、加速溶劑萃取等[8,9]。這些前處理技術各有特點,但都存在選擇性限制的弊端,樣品處理通量不高。例如,于潔等[10]對16種基質中120種獸藥同時篩查,前處理采用多次分步提取凈化步驟;張曉光等[11]檢測保健食品中的激素類物質,用乙腈作為提取液,沒有兼容強極性物質的提取;同樣地,新興的QuEChERS凈化方法也存在上述問題,不能保證強極性化合物的回收率[12]。如何把極性物質從水溶液中有效提取出來,這始終是一個艱巨的挑戰(zhàn)[13]。

隨著質譜的發(fā)展和推廣,一次進樣完成多類殘留分析已成為可能。獸藥殘留正逐漸由液相色譜-三重四極桿質譜(LC-MS/MS)目標型檢測向高分辨質譜(HRMS)精確質量非目標型全掃描檢測轉變[14-19]。傳統(tǒng)的LC-MS/MS在定量分析上具有優(yōu)勢,但分析化合物數(shù)量有限,只能針對方法中涵蓋的物質,并需要逐個進行參數(shù)優(yōu)化,耗時且對基質干擾敏感,相應的前處理也就更為復雜;而且分辨率低,不能有效區(qū)分相對分子質量相近的化合物,會造成假陽性結果等。全掃描高分辨質譜儀則不需要待測化合物的特征離子碎片,直接采集高準確度質量數(shù)(分辨率在70 000以上),對待測樣品進行全掃描,需要增加目標化合物時,不必再次進樣,重新分析已有的全掃描數(shù)據(jù)即可。在高分辨率下采集的數(shù)據(jù)降低了近似質量數(shù)的干擾,更好地避免了假陽性的發(fā)生。通過多級掃描,建立二級譜圖數(shù)據(jù)庫,特別適合高通量的檢測篩查。

本文利用載體輔助液液萃取技術,通過一次前處理,涵蓋了常見的理化性質差異很大的8大類共計99種獸藥殘留的提取、凈化工作,同時結合四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜,實現(xiàn)了畜類、禽類、液態(tài)乳、奶粉、魚類等動物源性食品中常見獸藥殘留的一步式多殘留篩查,為提高政府監(jiān)管部門的監(jiān)管工作效率,保證動物源性食品安全提供了基礎。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-Exactive四極桿靜電場軌道阱高分辨質譜儀(賽默飛世爾科技公司),配有H-ESI II源。液相色譜系統(tǒng)為UltiMate 3000高壓液相色譜,配有自動進樣器。色譜柱為Thermo Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)。Milli-Q高純水發(fā)生器(美國Millipore公司)。冷凍干燥機(美國LABCONCO公司);旋轉蒸發(fā)儀(德國IKA公司)。

獸藥標準品購自美國Sigma-Aldrich公司和德國Dr. Ehrenstorfer公司,純度≥95%?；|樣品來自國家植物源性殘留監(jiān)控抽樣和進出口送檢企業(yè)。硫酸銨、二甲基亞砜、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、氨水(均為分析純)購自南京化學試劑一廠;色譜純甲酸購自美國Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為色譜純,購自德國Merck公司。實驗用水為Milli-Q超純水(18.2 ΩM5cm)。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取10 mg標準品,用乙腈稀釋成1 000 mg/L的標準儲備液;將標準物質分為3組,配制混標,第一組為28種激素類化合物,第二組為39種磺胺喹諾酮類化合物,第三組為32種其他獸藥;分別準確吸取100 μL標準儲備液,用乙腈溶液定容至10 mL,配制10 mg/L混合標準溶液,于-20 ℃避光保存。

1.3 一步式提取凈化體系操作

提取液的配制:稱取4.3 g的草酸和3.7 g EDTA,用500 mL水溶解,氨水調pH至3.0; 100 mmol/L草酸緩沖液的配制:稱取0.9 g草酸,用90 mL水溶解,氨水調pH至5.0,加水至100 mL。

稱取5.00 g樣品,加入5 mL提取液和15 mL乙腈,振蕩5 min, 4 500 r/min下離心5 min;取出上清液,加入1 g硫酸銨,振蕩5 min, 4 500 r/min下離心5 min,得到乙腈層(上)和水層(下);取水層上樣,平衡15 min,乙腈作為洗脫液進行洗脫,再依次用10 mL乙腈清洗離心管2次,并依次上柱洗脫,下接50 mL離心管,并加入0.5 mL二甲基亞砜,乙腈定容至25 mL;取出12.5 mL,加入200 μL草酸緩沖液,氮吹后用純水定容至1.0 mL,過0.22 μm濾膜,高濃度的加標水平稀釋到線性范圍內,待分析。

1.4 色譜及質譜條件

液相色譜條件:色譜柱Hypersil Gold C18 (100 mm×2.1 mm 1.9 μm),部分激素成分(ESI-)的流動相A:含有0.1%(v/v)氨水的乙腈溶液;流動相B:含有0.1% (v/v)氨水的水溶液;混合標準溶液中其余成分(ESI+)的流動相A:含有0.1%(v/v)甲酸和5 mmol/L乙酸銨的乙腈溶液,流動相B:含有0.1%(v/v)甲酸和5 mmol/L乙酸銨的水溶液。流速:0.3 mL/min,進樣量:10 μL,梯度洗脫程序見表1。

表 1 ESI+和ESI-模式下的HPLC洗脫程序

質譜條件:質譜在正/負離子轉換模式下進行全掃描測定,質量范圍:m/z100～1 000,分辨率70 000,自動增益控制(AGC)目標值5×105;部分激素成分采用負離子模式2 700 V,其余成分則采用正離子模式3 800 V,離子傳輸管溫度為300 ℃,鞘氣壓(N2)35 arb,輔助氣壓(N2)10 arb,氣化室溫度350 ℃;在樣品運行前對儀器分別進行正、負離子校正;二級采用自動觸發(fā)模式,分辨率35 000, AGC目標值2×105,碰撞能量范圍25%～40%,保留時間采集范圍:根據(jù)一級色譜圖中各個目標物質的保留時間(RT)±1.00 min。

1.5 獸藥的定性、定量分析

定性分析:精確質量誤差低于5×10-6,同時比對保留時間、同位素分布、主要二級碎片和二級質譜圖相似度,綜合判斷后得到準確定性結果,避免假陽性結果出現(xiàn)。部分標準物質圖譜見圖1。

定量分析:用3組10 mg/L混合標準溶液配制系列濃度的標準溶液:0、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100 ng/mL,以質量濃度為橫坐標,標準品峰面積為縱坐標,做基質標準曲線,作為待測物定量的依據(jù)。部分標準物質在牛奶、豬肉、蝦基質中的線性方程和相關系數(shù)見附表1(http://www.chrom-china.com/UserFiles/File/SP1802023SI.pdf)。

圖 1 部分獸藥標準物質的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of some veterinary drugs

2 結果與討論

2.1 提取液的選擇

液體樣品或者固體水樣首先經過強極性水性提取液進行提取,可得到水溶性等強極性的獸藥,同時避免脂肪類等低極性物質的干擾。提取液中含有的EDTA也可以很好地絡合奶制品中的大量金屬離子;然后加入3倍體積的乙腈(15 mL),沉淀樣品水提液中的蛋白質組分。乙腈溶解性好、滲透強,已經成為食品基質中常用的提取溶劑,它同時可以防止極性相對偏弱的獸藥隨蛋白質沉淀而損失。

2.2 提取劑的添加量

提取液的添加量要充分考慮柱子的填料含量,本文選擇的硅藻土柱型號為Chromabond XTR (1 000 mg),分別比較了上樣量為5、8、10、12、15 mL時的柱負載,在上樣量達到12 mL和15 mL的時候,柱已達到飽和并滲出,水溶液的滲出會導致最后的氮吹濃縮過程大大延長。另外,當上樣量為5 mL和8 mL的時候,柱填料未充分浸入水溶液,大大降低了柱子的利用率,同時對于獸藥本就很低的檢出限量來說,也增加了儀器檢出的難度。因此,本研究最終將上樣體積確定為10 mL。

2.3 輔助提取劑乙腈的添加量

在分級提取過程中,乙腈作為水的輔助提取劑,其加入量對不同極性獸藥的提取率有很大的影響。向液體基質牛奶和固體基質豬肉樣品中添加99種禁限用獸藥,通過加入不同體積(5、10、15和20 mL)的乙腈,考察乙腈添加體積對上述獸藥添加回收率的影響。

結果表明,在兩種基質中,乙腈體積大于15 mL時的提取率趨于穩(wěn)定,均能達到60%以上?？紤]到樣品中脂肪成分的影響,最終確定其加入量為15 mL。代表性的3種獸藥阿莫西林(RT: 2.24 min)、雙氟沙星(RT: 8.03 min)和吡喹酮(RT: 24.42 min)的保留時間范圍完全涵蓋了上述99獸藥的洗脫時間。從圖2可見,3種代表性獸藥在牛奶和豬肉中的回收率均平穩(wěn)地保持在70%以上。

圖 2 提取時乙腈體積對3種獸藥加標回收率的影響(n=6)Fig. 2 Effect of the acetonitrile volume during extraction on the spiked recoveries of the three veterinary drugs (n=6)

2.4 洗脫體積的優(yōu)化

洗脫液主要來自兩部分,第一部分是作為輔助提取劑的乙腈,通過加入硫酸銨使乙腈從水相提取液中分離出來,得到的乙腈層位于離心管的上層,它作為水的輔助提取劑,很好地保證了弱極性獸藥的回收率。水相提取液上樣,位于離心管上層的乙腈作為洗脫液,逐級滲入,使一些強極性的獸藥首先從飽和的硅藻土柱上洗脫下來。第二部分的洗脫液是純乙腈,分別考查了10 mL、10 mL×2和10 mL×3乙腈作為洗脫溶劑對待測獸藥回收率的影響。同樣以代表性的3種獸藥阿莫西林、雙氟沙星和吡喹酮為例,從圖3可見,當乙腈體積為10 mL×2和10 mL×3時,提取率趨于穩(wěn)定,3種代表性獸藥在牛奶和豬肉中的回收率均平穩(wěn)地保持在70%以上。從節(jié)約氮吹濃縮的時間和成本的角度出發(fā),確定純乙腈作為洗脫液的洗脫體積為10 mL×2。

圖 3 洗脫時乙腈體積對3種代表性獸藥加標回收率的影響Fig. 3 Effect of the acetonitrile volume during elution on the spiked recoveries of the three veterinary drugs

2.5 液相色譜、質譜條件的優(yōu)化

本文采用UHPLC聯(lián)用高分辨臺式Q-Exactive質譜,全掃描和正、負離子切換模式進行測定,在MS和MS/MS模式下完成正、負極性的快速切換,通過提取一級質譜的精確質量數(shù)進行定性和定量,自動觸發(fā)二級，進一步提高定性的準確性,其超高的分辨率有助于解析復雜的樣品,確保Q-Exactive系統(tǒng)能夠在一次色譜運行中最大限度地檢測和鑒定代謝物。

99種禁限用獸藥種類和性質差別較大,為防止在混合標準溶液進樣時不同性質化合物發(fā)生相互反應,根據(jù)各物質的性質將其分為3組:第一組為28種激素類化合物,第二組為39種磺胺喹諾酮類化合物,第三組為32種其他獸藥。參照99種獸藥的電離性質,通過流動注射泵連續(xù)進樣,對每種獸藥的單標溶液進行全掃描,確定每種獸藥的電離方式和分子離子峰。其中部分激素類化合物采用ESI-模式,其余化合物采用ESI+模式。再分別輸入各目標化合物的分子式,由軟件計算精確分子式,可用工作站軟件自動解析待分析樣品的質譜掃描圖譜,綜合各種同位素豐度匹配比例、各種加合離子(如加H+、加Na+、加K+、二聚體、脫水峰、各種中性丟失),計算結果中精確質量數(shù)對應的可能的中性分子式組合,獲得每個化合物的分子離子峰后,進行二級質譜掃描,優(yōu)化碰撞能量,獲得碎裂片段。與建立的目標數(shù)據(jù)庫中化合物的分子式、碎裂片段質量數(shù)比較,并結合色譜保留時間,篩查是否包含數(shù)據(jù)庫中獸藥,從而實現(xiàn)目標獸藥的快速篩查。

在流動相中加入0.1%(v/v)甲酸能增加正離子檢測模式下獸藥的電離效率,促進[M+H]+離子生成,因此針對正離子模式下檢測的獸藥,添加了0.1%(v/v)甲酸。同時也進一步考察了乙酸銨緩沖液離子強度的影響,乙酸銨溶液濃度從2 mmol/L變化到10 mmol/L的結果表明,以乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%(v/v)甲酸)作為流動相時獲得了最優(yōu)的色譜峰形、分離效果和質譜信號響應。相應地,負離子模式測定的激素類獸藥則以含0.1%(v/v)氨水的水-乙腈溶液作為流動相。全過程選擇梯度洗脫方式,通過優(yōu)化流動相梯度洗脫條件實現(xiàn)了99種獸藥的有效分離。

另外,比較了Hypersil Gold C18色譜柱和Hypersil Gold C8色譜柱,發(fā)現(xiàn)兩柱只顯示出組分保留時間的差異,在分離度方面均可滿足質譜檢測的需要。另外,針對2款不同規(guī)格的色譜柱(100 mm×2. 1 mm, 1.9 μm；100 mm×2.1 mm, 3 μm)進行了比較,同樣壓力下,結果也只顯示出保留時間的極小差異。由于小粒徑色譜柱流速更低,可以很好地節(jié)約有機溶劑,因此最終選擇色譜柱為Hypersil Gold C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)。

2.6 加標回收試驗結果的分析

各獸藥的線性范圍為0.001～0.1 μg/mL,檢出限為0.000 5～0.02 mg/kg,加標回收率為60%～120%,標準偏差在15%以內(見表2～表8)。

結果表明,本方法對液態(tài)乳、豬肉、魚類等食品基質具有較強的適用性,無論是脂溶性還是水溶性獸藥,都可以一步完成提取、凈化流程。

表 2 (續(xù))

表 2 (續(xù))

表 3 (續(xù))

表 4 10種紅霉素類藥物的加標回收率和相對標準偏差(n=6)

表 8 (續(xù))

3 結論

基于載體輔助液液萃取技術,通過一次性前處理完理化性質差異很大的常見8大類共計99種獸藥殘留的提取、凈化,同時結合高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜進行測定,20 min內可完成99種獸藥殘留的高通量篩選和確認。高分辨率質譜在復雜基質樣品分析中消除了基質的干擾,提高了定性和定量的準確性,自動觸發(fā)模式提供的二級碎片進一步提高了定性的準確性。方法的檢出限可滿足國內外相關獸藥殘留限量的要求,可作為一種快速篩選和確證檢測技術廣泛使用。

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