楊秋紅, 劉 歡, 鄒譜心, 戚銘隆, 劉永濤, 艾曉輝*

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所, 湖北 武漢 430223; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院, 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100141; 3. 成都信息工程大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 四川 成都 610225)

二甲戊靈(pendimethalin)屬于二硝基苯胺類除草劑[1],其主要防除對象是一年生禾本科雜草、部分闊葉雜草,可廣泛用于玉米、大豆、大蒜、蔥、甘藍(lán)、煙草、花生、棉花、水稻等多種作物的農(nóng)田除草中[2-6],現(xiàn)已成為僅次于草甘膦和百草枯的第三大除草劑[7]。隨著二甲戊靈的大量使用,二甲戊靈的生態(tài)毒性越來越多的引起人們的關(guān)注。有研究表明,二甲戊靈對水生動物有一定的毒性,甚至是可疑致癌物。美國環(huán)境保護(hù)署定義二甲戊靈具有持久性、生物累積性和毒性物質(zhì)(毒性分類Ⅲ),可能具有致癌毒性(等級C)[1]。

二甲戊靈的主要檢測方法有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法等[8-12]。液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法較液相色譜法,具有靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點(diǎn);較氣相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法,具有穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。目前僅有采用液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定水體中二甲戊靈的方法[12],但克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)中二甲戊靈的檢測方法未見報(bào)道。

本文建立了高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜準(zhǔn)確測定克氏原螯蝦體內(nèi)二甲戊靈殘留的方法。該法為水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)控提供簡便、快速的檢測技術(shù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

Accela-TSQ Quantum Access Max高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀,配有Thermo LC-Quan 2.6數(shù)據(jù)采集處理軟件(美國Thermo公司); AE-240電子天平(美國梅特勒-托利多公司); Hei-VAP旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司); 20PR-520自動高速冷凍離心機(jī)(日本Hitach公司); HQ-60渦旋混合器(北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司); HR2105/90高速攪碎機(jī)(美國飛利浦公司); SK40-120DJ超聲儀(張家港市神科超聲電子有限公司)。

二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.8%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);弗羅里硅柱(1 g/3 mL)、中性氧化鋁柱(1 g/3 mL)和乙酸、乙腈、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯(色譜純)(美國CNW公司);乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)(博納艾杰爾科技公司);超純水(電阻率為18.2 MΩ5cm,美國Millipore公司)。

1.2 樣品前處理

1.2.1制備

克氏原螯蝦去頭、去殼、去蝦線,取可食肌肉部分,處理成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后,混勻,用高速攪碎機(jī)充分?jǐn)噭?密封,標(biāo)記,于-18 ℃冷凍保存,備用。

1.2.2提取

稱取(5.00±0.01) g解凍后的克氏原螯蝦樣品,置于50 mL具塞離心管中,加入15 mL含0.1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯溶液,渦旋混勻1 min,于室溫下超聲振蕩提取5 min,以5 000 r/min離心5 min,取上層清液至雞心瓶中,重復(fù)萃取一次,合并上清液并旋蒸至干,殘?jiān)? mL含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-水溶液(8∶2, v/v)溶解,轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中,過酸性氧化鋁柱后,加入0.1 g GCB,以5 000 r/min離心5 min,取上層清液1 mL,用HPLC-MS/MS測定。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)品1.00 mg,置于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-18 ℃冰箱中避光保存;用含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-水(8∶2, v/v)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

采用1.2節(jié)前處理方法處理空白克氏原螯蝦樣品,制備得到空白樣品溶液,用空白樣品溶液稀釋二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 色譜條件

色譜柱:Symmetry C18柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm,美國Waters公司);柱溫:35 ℃;流動相:(A)含0.1%(v/v)乙酸的甲醇溶液和(B)0.1%(v/v)乙酸水溶液;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表1。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:加熱大氣壓電噴霧(HESI)源，正離子模式;掃描方式:選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式;噴霧電壓:3 500 V;蒸發(fā)氣溫度:200 ℃;鞘氣和輔助氣:高純氮?dú)?壓力均為5 bar;碰撞氣:高純氬氣,壓力為0.2 Pa;離子傳輸毛細(xì)管溫度:350 ℃;一極質(zhì)譜掃描(Q1)半峰寬:0.7 Da,三極質(zhì)譜掃描(Q3)半峰寬:0.7 Da;監(jiān)測離子對:m/z282.1/211.9(定量離子)和282.1/193.9:碰撞壓力:17 V和11 V。

表 1 梯度洗脫程序

A: methanol containing 0.1% (v/v) acetic acid; B: water containing 0.1% (v/v) acetic acid.

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

本試驗(yàn)比較了甲醇、甲醇-水(5∶5, v/v)、甲醇-水(8∶2, v/v)和含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液(8∶2, v/v)4種流動相組合在等度洗脫條件下二甲戊靈的分離效果。采用甲醇時(shí),二甲戊靈的色譜峰較寬,且拖尾明顯;采用甲醇-水(5∶5, v/v)時(shí),二甲戊靈的出峰時(shí)間較長,且色譜峰較寬;采用甲醇-水(8∶2, v/v)時(shí),雖然沒有明顯的拖尾現(xiàn)象,但二甲戊靈的色譜峰較寬;采用含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液(8∶2, v/v)時(shí),二甲戊靈的色譜峰較窄、峰形尖銳,且響應(yīng)強(qiáng)度也高。因此采用含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液作為流動相。

采用等度洗脫時(shí),雖然靈敏度較高,但是色譜峰略微出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,因此采用梯度洗脫程序(見表1),以解決色譜峰拖尾問題。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用蠕動泵將標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀,在ESI+模式下對目標(biāo)化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜分析,試驗(yàn)比較了直接注入標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液隨初始流動相同時(shí)注入兩種方式的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),直接注入標(biāo)準(zhǔn)溶液,目標(biāo)化合物離子峰響應(yīng)極低;標(biāo)準(zhǔn)溶液隨初始流動相注入后,目標(biāo)化合物離子峰響應(yīng)值較高。

2.3 提取溶劑的選擇

常用的水產(chǎn)品提取溶劑有乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷及其混合溶劑。本試驗(yàn)比較了乙腈、丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯和含0.1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯作為提取劑時(shí),克氏原螯蝦中二甲戊靈的提取效率(見圖1)。結(jié)果表明,乙腈、丙酮能從樣品中提取大量色素等雜質(zhì),不利于后續(xù)凈化,難以獲得較高的回收率;二氯甲烷難以溶解水產(chǎn)品中的脂肪,提取液渾濁;乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí),提取液澄清透明,獲得的色譜圖雜峰較少,且色譜峰形較好,但回收率仍不理想;采用含0.1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí),得到的色譜圖峰形好,靈敏度高,且二甲戊靈的回收率較高,滿足分析要求。因此最終選擇含0.1%(v/v)乙酸的乙酸乙酯作為提取溶劑。

圖 1 不同提取溶劑對克氏原螯蝦中二甲戊靈回收率的影響Fig. 1 Effects of different extraction solvent on the recoveries of pendimethalin in Procambarus clarkii samples

圖 2 不同凈化材料對克氏原螯蝦中二甲戊靈回收率的影響Fig. 2 Effect of different purification materials on the recoveries of pendimethalin in Procambarus clarkii samples A-AL: acidic alumina; GCB: graphitized carbon black; PSA: primary secondary amine.

2.4 凈化條件的優(yōu)化

分別使用弗羅里硅柱、酸性氧化鋁柱、GCB、PSA、酸性氧化鋁柱+GCB、C18+PSA、C18+GCB凈化提取濃縮物。如圖2所示,采用酸性氧化鋁柱且配合使用GCB吸附劑凈化時(shí)效果最佳,回收率最高。

2.5 溶解液的選擇

試驗(yàn)比較了甲醇、含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-水(8∶2, v/v)分別溶解殘?jiān)竽繕?biāo)化合物的色譜響應(yīng)。采用甲醇溶解殘?jiān)鼤r(shí)二甲戊靈的色譜峰峰形不對稱,且靈敏度較低;采用含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-水(8∶2, v/v)溶解殘?jiān)?二甲戊靈的色譜峰峰形尖銳,靈敏度高。因此選用含0.1%(v/v)乙酸的甲醇-水(8∶2, v/v)作為旋蒸后的溶解液。

2.6 線性范圍和檢出限

在優(yōu)化的條件下對系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定,以二甲戊靈的色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X, mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,二甲戊靈在1.0～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性相關(guān),線性方程為Y=24.5×104X-39.1×104,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.996 0。

在不含目標(biāo)化合物的空白克氏原螯蝦中添加一定含量的二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液,并對其進(jìn)行分析,根據(jù)7個(gè)空白樣品基線噪聲的平均值計(jì)算方法的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10),分別為0.2 μg/kg和0.6 μg/kg,滿足殘留分析的要求。

2.7 基質(zhì)效應(yīng)

在優(yōu)化的條件下,對1.3節(jié)配制的克氏原螯蝦空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定,按2.6節(jié)描述繪制空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率之比(M)對基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評價(jià),其比值越接近1,說明基質(zhì)效應(yīng)越小,反之亦然。結(jié)果表明,M=1.13,說明基質(zhì)效應(yīng)較小,因此可直接采用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

2.8 回收率和精密度

向克氏原螯蝦樣品中分別添加低、中、高(1.2、6.0、12.0 μg/kg)3個(gè)水平的二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)品,每個(gè)添加水平同時(shí)做7個(gè)平行樣品,進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。結(jié)果表明,加標(biāo)樣品中二甲戊靈的回收率為63.3%～104.7%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.9%～14.5%(n=7)。

2.9 實(shí)際樣品測定

在稻蝦綜合種養(yǎng)試驗(yàn)地隨機(jī)抽檢20組克氏原螯蝦樣品,按1.2節(jié)和1.4節(jié)進(jìn)行前處理和分析。結(jié)果表明,有兩個(gè)樣品檢出二甲戊靈,含量分別為0.803 μg/kg和0.711 μg/kg,檢出率僅為13.3%。二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/L)、空白克氏原螯蝦樣品和加標(biāo)克氏原螯蝦樣品(2 μg/kg)的色譜圖見圖3。

圖 3 二甲戊靈標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白克氏原螯蝦和加標(biāo)克氏 原螯蝦樣品的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of pendimethalin in a standard solution, a blank Procambarus clarkia sample and a spiked Procambarus clarkia sample

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜測定克氏原螯蝦中二甲戊靈殘留的分析方法。該方法前處理操作簡單,回收率高,重復(fù)性好,靈敏度高,適合克氏原螯蝦中二甲戊靈物質(zhì)的殘留分析。

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