高芳芳, 劉軍英, 鹿文慧, 李金花*, 劉惠濤

(1. 煙臺大學化學化工學院, 山東 煙臺 264005; 2. 中國科學院煙臺海岸帶研究所,中國科學院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復重點實驗室, 山東 煙臺 264003)

酚類雌激素(phenolic estrogens, PEs)是指結構中含有酚基且具有類雌激素效應的化合物,由于其具有較高的脂溶性,極易被生物體富集,威脅生態(tài)系統(tǒng),嚴重危害人類健康和發(fā)展,從而成為人們重點關注的對象[1]。己烷雌酚(HS)、雙烯雌酚(DS)、己烯雌酚(DES)和雙酚A(BPA)4種PEs被廣泛應用于促進畜禽生長,提高牛奶產量,增加瘦肉率等[2]。雙酚A作為環(huán)氧樹脂等工業(yè)原料的前體物質,是最常見的內分泌干擾物之一[3,4]。此外,已經證明PEs廣泛存在于環(huán)境中的水體、沉積物等基質中[5,6],在環(huán)境基質中的含量在0～10 ng/g范圍內,在污水中的含量更高[7]。PEs可以通過食物鏈進入人體,使人體的代謝紊亂,破壞生理平衡,甚至癌變[8,9]。PEs的含量在幾ng/L的質量濃度水平就會對人體的代謝產生影響[10]。很多國家和地區(qū)已經規(guī)定了這類雌激素在水體中的最大殘留量為0.1 μg/L或者更低的質量濃度。因此,快速準確地檢測這類化合物是十分必要的。

目前,檢測PEs的方法主要有高效液相色譜[11,12]、氣相色譜[13]、毛細管電泳(CE)[14]及免疫法[15]等。近年來,CE以其柱效高、分析速度快、試劑消耗少等特點發(fā)展迅速,已廣泛應用于各個領域[16]。然而,由于CE進樣量少,紫外檢測器的光程短,因此檢測的靈敏度較低[17]。CE的在線富集技術是其特有的富集方法,只需對樣品溶液和儀器進行適當?shù)恼{整,即可實現(xiàn)樣品的在線堆積,操作簡便[18,19]。壓力輔助電動進樣(pressure-assisted electrokinetic injection, PAEKI)是通過調節(jié)給定電壓下的壓力或者是給定壓力下的電壓來使毛細管內的電滲流保持平衡,在此狀態(tài)下,再采用電動進樣[20]。目前,CE-PAEKI已被廣泛用于砷、硒等的形態(tài)分析[21],精氨酸、咪唑的分析[22],以及人工尿液中維替泊芬藥物的手性拆分和檢測[23]等。

我們擬以HS、DS、DES和BPA這4種PEs為研究對象,采用PAEKI的在線富集方式實現(xiàn)其在毛細管入口端的堆積富集,提高CE-UV的靈敏度[24]。對影響富集效果的條件進行優(yōu)化,包括進樣電壓、進樣時間、注入水柱的選擇等[25,26]。相較于普通的壓力進樣,該PAEKI法簡單、快速,可以得到較高的富集倍數(shù)和更低的檢出限。我們采用膠束電動色譜(MEKC)模式進行了電泳分離[27],結合PAEKI,實現(xiàn)了對自來水和湖水中4種PEs的同時高效測定,為雌激素的痕量分析提供了一種快速、準確、靈敏的分析方法。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

P/ACE MDQ CE毛細管電泳儀(美國貝克曼公司),檢測器為二極管陣列檢測器;裸熔融石英毛細管(內徑75 μm,外徑375 μm,總長50.2 cm,有效分離長度40 cm)(河北永年光導纖維廠);雷磁PHs-3C型pH計(上海精密科學儀器有限公司); TG16-WS臺式高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司);電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

HS、DS、DES、BPA 4種PEs的標準品(純度不低于98%)均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。十二烷基硫酸鈉(SDS)購自上海阿拉丁公司。色譜級乙腈和甲醇購自北京百靈威化學公司;其他化學試劑如氫氧化鈉(NaOH)、硼砂(Na2B4O7510H2O)等均為分析純,均購自國藥集團化學試劑有限公司。超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備,電阻率為18.2 MΩ5cm。

自來水取自實驗室,自流5 min后收集;湖水取自煙臺大學校園內的人工湖。采集時分別用自來水和湖水沖洗取樣器3次,并采用0.22 μm親水性聚丙烯濾膜過濾,過濾后的樣品置于4 ℃冰箱保存。

1.2 溶液配制

標準溶液:準確稱取適量的標準物質溶于甲醇,配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準貯備液,用超純水稀釋標準溶液得到相應濃度的工作溶液,于4 ℃冰箱內避光保存。

圖 1 電壓對4種PEs峰高的影響Fig. 1 Effect of voltage on the peak height of four phenolic estrogens (PEs) HS: hexestrol; BPA: bisphenol A; DES: diethylstilbestrol; DS: dienestrol.

MEKC緩沖溶液:由10 mmol/L Na2B4O7510H2O、20 mmol/L的SDS和40% (v/v)的乙腈組成,用1.0 mol/L的NaOH調節(jié)緩沖液pH為10.8。1.3實驗方法

新使用的毛細管分別用超純水、1.0 mol/L的NaOH、超純水和緩沖溶液依次沖洗10、40、10和30 min。每天使用前用超純水、1.0 mol/L的NaOH、超純水和緩沖溶液沖洗2、10、5和5 min。兩次進樣間隔使用緩沖溶液沖洗3 min。

檢測條件:分離電壓為+28 kV;檢測波長228 nm; PAEKI進樣條件為-9 kV電壓下壓力進樣,進樣壓力0.3 psi (約2.1 kPa),進樣時間0.4 min,不注入水柱進樣。

2 結果與討論

2.1 進樣條件的優(yōu)化

采用PAEKI的進樣方式在線富集分析物,對影響堆積效率的參數(shù)進行了優(yōu)化。

2.1.1進樣電壓的優(yōu)化

首先,設置壓力為0.3 psi (約2.1 kPa),進樣時間為0.4 min,對進樣電壓進行考察。如圖1所示,富集效率隨著進樣電壓的增大而升高,可見電壓越大,有越多的分析物進入毛細管,堆積效果越好。然而,當電壓過大時,峰形開始變差,峰高開始減小,這可能是因為過大的電滲流將分析物推出毛細管口,使堆積效果變差。此外,我們還發(fā)現(xiàn)當電壓較大時,電泳分離容易出現(xiàn)斷流情況,重復性較差,且和毛細管柱的使用程度、沖洗狀態(tài)有較大的關系。在進樣電壓為-9 kV時,有最好的峰形和堆積效果。因此,選擇進樣電壓為-9 kV,進樣壓力為2.1 kPa。

2.1.2進樣時間的優(yōu)化

在電壓-9 kV、壓力2.1 kPa條件下對進樣時間進行了考察。從圖2可以看出,在0.2～0.4 min時,堆積效果隨著進樣時間的增加而增加;但當時間超過0.4 min以后,峰高增加不明顯,且DES和DS的峰高有所下降。當進樣時間為0.5 min時,峰形展寬,分離度下降,這可能是進樣量過多的原因。因此,選擇進樣時間為0.4 min。

圖 2 進樣時間對4種分析物峰高的影響Fig. 2 Effect of injection time on the peak height of the four PEs

2.1.3注入水柱的選擇

進一步考察電泳的在線富集效果,在壓力輔助電動進樣之前,預先注入一段水柱(0.5 psi (約3.4 kPa), 6 s)?？疾炝祟A先引入水柱對于富集效果的影響,發(fā)現(xiàn)電泳檢測時斷流情況較為嚴重,且分析物峰形較差。因此選擇不注入水柱進樣。

2.2 PAEKI和普通進樣的對比

圖3給出了在相同的分析物濃度條件下,普通壓力進樣(3.4 kPa, 3 s)的電泳圖和最優(yōu)的PAEKI條件(-9 kV, 2.1 kPa)下的電泳圖?？梢钥闯?PAEKI和普通的壓力進樣相比具有較明顯的堆積效果。在最優(yōu)的PAEKI條件下,4種分析物的富集倍數(shù)是普通壓力進樣的11～15倍。

2.3 線性關系及檢出限

在最優(yōu)的電泳條件下,4種分析物在7 min內基線分離。配制質量濃度為0.05～10 mg/L的混合標準溶液,在最優(yōu)的PAEKI的條件下進行電泳分析,以分析物的峰高為縱坐標、質量濃度為橫坐標,繪制校正曲線,4種雌激素在各自的范圍(HS和DS為0.05～5 mg/L, BPA和DES為0.1～10 mg/L)內線性關系良好,相關系數(shù)(r)均≥0.993 6。以目標物的峰高與背景噪聲的3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(LOD)。由表1可見,4種分析物的檢出限為0.007 1～0.017 mg/L,達到痕量分析要求。

圖 3 (a)普通壓力進樣和(b)壓力輔助電動進樣的電泳圖Fig. 3 Electrophoregrams of (a) usual pressure injection and (b) pressure-assisted electrokinetic injection (PAEKI) a. The mass concentrations of HS, BPA, DES, and DS were 1, 2, 2 and 1 mg/L, respectively; b. The mass concentrations of HS, BPA, DES, and DS were 2.5, 5, 5 and 2.5 mg/L, respectively.

表 3 自來水和湖水樣品中4種雌激素的加標回收率和相對標準偏差(n=5)

ND: not detected.

y: peak height;x: mass concentration, mg/L.

采用質量濃度分別為5、10、10和5 mg/L的HS、BPA、DES和DS的混合標準溶液,對MEKC-PAEKI測定4種PEs的精密度進行了考察。由表2可見,遷移時間的日內精密度為0.1%,日間精密度為1.3%～2.0%;峰面積的日內精密度為2.2%～2.8%,日間精密度為2.6%～3.3%。結果表明該方法穩(wěn)定、可靠,適于準確測定。

表 2 PAEKI測定PEs遷移時間和峰面積的精密度*

* Spiking HS, BPA, DES, and DS at 5, 10, 10, and 5 mg/L, respectively.

2.4 實際樣品檢測及加標回收試驗

為進一步評價方法的實際應用價值,將建立的MEKC-PAEKI方法用于自來水和湖水樣品中4種PEs殘留的檢測。以目標物的峰高與背景噪聲10倍信噪比(S/N)計算方法的定量限(LOQ)。4種分析物在自來水中的LOQ分別為0.064 mg/L(HS)、0.029 mg/L(BPA)、0.063 mg/L(DES)和0.034 mg/L(DS),在湖水中的LOQ分別為0.071 mg/L(HS)、0.033 mg/L(BPA)、0.079 mg/L(DES)和0.038 mg/L(DS)?？梢?此方法能夠對實際水樣中的痕量雌激素進行定量分析。

圖 4 自來水、湖水空白樣品和加標樣品中4種PEs的電泳圖Fig. 4 Electrophoregrams of the four PEs in blank and spiked samples of tap water and lake water a. without spiking; b. spiked with 0.5 mg/L HS, 1 mg/L BPA, 1 mg/L DES and 0.5 mg/L DS; c. spiked with 1 mg/L HS, 2 mg/L BPA, 2 mg/L DES and 1 mg/L DS.

對實際樣品進行加標回收實驗,自來水、湖水樣品中4種雌激素的加標水平分別為0、0.5、1或2 mg/L,每個水平進行5次平行實驗。測定結果見表3,電泳圖見圖4。由表3可以看出,自來水中4種PEs的加標回收率為80.1%～110.1%,相對標準偏差為5.4%～11.8%;湖水樣品中加標回收率為75.6%～105.9%,相對標準偏差為4.6%～10.9%。以上結果表明,所建立的MEKC-PAEKI方法適用實際水樣中多種酚類雌激素殘留的同時分離和檢測。

3 結論

本實驗采用MEKC-PAEKI方法對自來水和湖水中痕量酚類雌激素進行在線富集和分析檢測。PAEKI具有較好的富集效果,實際水樣分析結果滿意。PAEKI不需要樣品前處理的富集過程,只需要對儀器進行簡單的調試,方法簡單、快速、無污染。并且,對于環(huán)境中基質復雜的樣品,PAEKI還可以和其他的樣品前處理技術連用,如液液萃取和固相萃取,進一步凈化和富集樣品,提高富集倍數(shù),降低檢出限,為酚類雌激素的檢測提供了一條行之有效的途徑。

參考文獻:

[1] Sosvorova L K, Chlupacova T, Vitku J, et al. Talanta, 2017, 174: 21

[2] Lin Z A, Pang J L, Huang H, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2010, 29(1): 55

林子俺, 龐紀磊, 黃慧, 等. 分析測試學報, 2010, 29(1): 55

[3] Sarigiannis D A, Karakitsios S P, Handakas E, et al. Food Chem Toxicol, 2016, 98: 134

[4] Chen S J, Chen X R, Yan L, et al. Environmental Science, 2014, 35(4): 1457

陳善佳, 陳秀榮, 閆龍, 等. 環(huán)境科學, 2014, 35(4): 1457

[5] Chou P H, Lin Y L, Liu T C, et al. Chemosphere, 2015, 138: 814

[6] Ballesteros-Gómez A, Rubio S, Pérez-Bendito D. J Chromatogr A, 2009, 1216(3): 449

[7] Lei B L, Huang S B, Zhou Y Q, et al. Chemosphere, 2009, 76(1): 36

[8] Wang Y K, Wang M, Wang H L, et al. Food Chem, 2015, 173: 1213

[9] Yu L L, Yuan D Z, Zhang S M, et al. Acta Physiologica Sinica, 2016, 68(4): 547

喻琳麟, 袁東智, 張詩茂, 等. 生理學報, 2016, 68(4): 547

[10] Flint S, Markle T, Thompson S, et al. J Environ Manage, 2012, 104: 19

[11] Pan S D, He Q, Chen X H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(9): 980

潘勝東, 何仟, 陳曉紅, 等. 色譜, 2017, 35(9): 980

[12] Zou Y M, Zhang Z, Shao X L, et al. Water Sci Technol, 2014, 69(5): 1028

[13] Zhao J L, Ying G G, Wang L, et al. Sci Total Envir, 2009, 407(2): 962

[14] Wen Y Y, Li J H, Liu J S, et al. Anal Bioanal Chem, 2013, 405(17): 5843

[15] Wang L J, Zhang Y F, Liu G F, et al. Steroids, 2014, 89: 41

[16] Lu W H, Ming W N, Zhang X S, et al. Electrophoresis, 2016, 37(19): 2487

[17] Gallart-Ayala H, Núnez O, Moyano E, et al. Electrophoresis, 2010, 31(9): 1550

[18] Wen Y Y, Li J H, Ma J P, et al. Electrophoresis, 2012, 33(19/20): 2933

[19] Xu Z Q, Ye F, Wang Y L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(9): 988

徐中其, 葉峰, 王永樂, 等. 色譜, 2015, 33(9): 988

[20] Huang L F, He M, Chen B B, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(10): 1066

黃林芳, 何蔓, 陳貝貝, 等. 色譜, 2014, 32(10): 1066

[21] Zhang H, Gavina J, Feng Y L. J Chromatogr A, 2011, 1218(20): 3095

[22] D′Ulivo L, Feng Y L. Electrophoresis, 2015, 36(7/8): 1024

[23] Xu Z Q, Li A M, Wang Y L, et al. J Chromatogr A, 2014, 1355(9): 284

[24] Liu Q Q, Jia L, Hu C F. Chromatographia, 2010, 72(1/2): 95

[25] Zhou J, Yue M E. Chemical Reagents, 2015, 37(2): 142

周建, 岳美娥. 化學試劑, 2015, 37(2): 142

[26] Liu Q Q, Liu Y L, Yu G, et al. J Sep Sci, 2009, 32(7): 1011

[27] Liu J Y, Lu W H, Liu H T, et al. Electrophoresis, 2016, 37: 2502