陳蕭蕭，黃敏玲，汪薇，任文彬，白衛(wèi)東，劉功良

(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣州510225)

0 引言

奶味香精是香精香料領(lǐng)域中投資最大、開(kāi)發(fā)研究最為活躍的香精之一，可以給食品原料賦香，矯正不良?xì)馕?，彌補(bǔ)食品中原香氣的不足，輔助和穩(wěn)定食品中固有香氣[1-2]。而以酶解乳脂為基料的復(fù)合型奶香香精能克服了調(diào)配型奶味香精口感單薄的缺陷，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[3-4]。但由于酶的造價(jià)比較高，而且使用游離酶進(jìn)行酶解反應(yīng)時(shí)，酶只能使用一次而不能回收，導(dǎo)致產(chǎn)物的生產(chǎn)成本較高且后續(xù)分離步驟復(fù)雜，影響了利用酶應(yīng)用的商業(yè)化。與游離酶相比，共固定化酶能同時(shí)固定化多種酶，還能保持其高效、專(zhuān)一及溫和酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，還具有貯存穩(wěn)定性高、分離回收容易、可多次重復(fù)使用、操作連續(xù)及可控、工藝簡(jiǎn)便等一系列優(yōu)點(diǎn)[5-7]。本文將蛋白酶和脂肪酶進(jìn)行共固定化，探討了其對(duì)制備奶香基料的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

多美鮮無(wú)鹽黃油，乳清粉，脂肪酶A 12 K，脂肪酶M ER和蛋白酶M SD由阿瑪諾天野酶制劑，海藻酸鈉，CaC l2，乙醇，乙醚，氫氧化鉀，酚酞指示劑等均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 共固定化酶的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 g海藻酸鈉固體，加入去離子水，加熱溶解，配成1%的海藻酸鈉溶液。待冷卻到45℃后，加入10 m g游離酶，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅?號(hào)注射器滴入到100 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的CaC l2溶液中，形成凝膠顆粒，35℃下靜置固化1 h。濾出凝膠顆粒并保留濾液，凝膠顆粒用去離子水洗滌，抽濾后在4℃下保存。

1.2.2 酶解工藝流程

稱(chēng)取適量黃油→添加水和輔助底物→75℃，預(yù)殺菌20m in→降溫至室溫→添加適量脂肪酶→于設(shè)定溫下進(jìn)行水解一定時(shí)間→90℃滅酶10m in→添加適量蛋白酶→于設(shè)定溫度下進(jìn)行水解一定時(shí)間→90℃滅酶10m in

1.2.3 共固定化酶添加量對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

分別往6個(gè)錐形瓶中加入10 g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為黃油質(zhì)量的12.5%，加水量為黃油質(zhì)量的60%，置于恒溫水浴鍋中（75℃，20 m in）滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶，添加量為黃油質(zhì)量的0%，25%，50%，75%，100%，125%；置于恒溫?fù)u床中（35℃，150 r/m in）反應(yīng)2 h。濾出固定化酶后3 000 r/m in離心15 m in，取上層油相，測(cè)定酶解后黃油的酸價(jià)，并對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.4 共固定化酶的酶解時(shí)間對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

分別往6個(gè)錐形瓶中加入10 g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為黃油質(zhì)量的12.5%，加水量為黃油質(zhì)量的60%，置于恒溫水浴鍋中（75℃，20 m in）滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶為黃油質(zhì)量的100%，置于恒溫?fù)u床中（35℃，150 r/m in）反應(yīng)2 h。濾出固定化酶后3 000r/m in離心15 m in，取上層油相，測(cè)定酶解后黃油的酸價(jià)，并對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.5 共固定化酶的酶解溫度對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

分別往6個(gè)錐形瓶中加入10 g黃油作為底物，輔底物乳清粉添加量為黃油質(zhì)量的12.5%，加水量為黃油質(zhì)量的60%，置于恒溫水浴鍋中（75℃，20 m in）滅菌后，冷卻至室溫后再分別添加共固定化酶為黃油質(zhì)量的100%，分別置于30，35，40，45，50，55℃的恒溫?fù)u床中150 r/m in反應(yīng)2 h。濾出固定化酶后3 000 r/m in離心15 m in，取上層油相，測(cè)定酶解后黃油的酸價(jià)，并對(duì)產(chǎn)生的香氣進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.2.6 酸價(jià)測(cè)定

測(cè)定方法參考《動(dòng)植物油脂酸值和酸度測(cè)定》（GB/T 5530－2005）。

1.2.7 酥性餅干的制作

選用優(yōu)質(zhì)原輔料，面粉∶糖∶油∶水∶膨松劑的比例為50∶15∶10∶6∶0.8。把稱(chēng)好的糖用按比例稱(chēng)量的水溶解，在盤(pán)中把油用電動(dòng)攪拌器高速攪拌30 s，加入稱(chēng)量好的面粉和膨松劑，把溶解好的糖水倒入，用手揉勻，加入面粉重量0.25%的奶香基料，用手揉勻，輥壓到大概5 mm的厚度，用模子印出餅干形狀，放入烤箱150℃烤制30 m in即可，同時(shí)制作不添加奶香基料的餅干作為空白對(duì)照。

1.2.8 感官評(píng)價(jià)

選定若干個(gè)人組成感官評(píng)價(jià)鑒定小組，按表1分別對(duì)酶解產(chǎn)物的香氣強(qiáng)度、香氣純度和留香情況進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分結(jié)果為3者之和，總分為10。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 共固定化酶添加量對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

酶催化生成奶香香基時(shí)，酶的添加量對(duì)香基的風(fēng)味影響較大。酶的添加量較少時(shí)，生成的風(fēng)味物質(zhì)的量少，奶香味較淡；酶添加量過(guò)多時(shí)，雖可產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)，卻會(huì)產(chǎn)生某些不良?xì)馕?，同時(shí)也會(huì)增加生產(chǎn)成本[8]。因此，應(yīng)選擇合適的共固定化酶添加量。

由圖1和表2可知，當(dāng)共固定化酶添加量小于黃油質(zhì)量的100%時(shí)，隨著共固定化酶的增加，產(chǎn)香效果越好，香氣越濃郁。共固定化酶等于黃油質(zhì)量的100%時(shí)，所得到的奶香香基為甜香型奶味，香氣濃郁、圓潤(rùn)且回味悠長(zhǎng)，此時(shí)測(cè)得酸價(jià)為1.86 m g/g。當(dāng)共固定化酶添加量大于黃油質(zhì)量的100%時(shí)，開(kāi)始產(chǎn)生酸臊味，且隨著加酶量的增加，奶香香基的酸價(jià)增加較快，酸臊味越來(lái)越嚴(yán)重。綜合考慮，最適宜的共固定化酶的添加量為黃油質(zhì)量的100%。

表1 香氣評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

圖1 共固定化酶添加量對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

表2 共固定化酶添加量對(duì)奶香基料的感官影響

2.2 共固定化酶的酶解時(shí)間對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

為了得到最好的效果和提高生產(chǎn)效率，選擇合適的酶解時(shí)間也是很重要的。就理論而言，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，酶解反應(yīng)越徹底。事實(shí)上，過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間會(huì)生成較多的不良風(fēng)味物質(zhì)，影響香基的整體風(fēng)味。但是當(dāng)酶解時(shí)間過(guò)短時(shí)，酶解反應(yīng)不完全，風(fēng)味物質(zhì)生成過(guò)少，風(fēng)味沒(méi)有充分形成。要香基達(dá)到理想的風(fēng)味，酶解反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制好[8]。

圖2 共固定化酶的酶解時(shí)間對(duì)對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

表3 酶解時(shí)間對(duì)奶香基料的感官影響

從圖2和表3可以看出，酶解產(chǎn)物的酸價(jià)隨著酶解時(shí)間的增加而增大。當(dāng)酶解時(shí)間是2 h時(shí)，產(chǎn)香效果最好，所得奶香香基香氣濃郁、圓潤(rùn)，并與奶甜味協(xié)調(diào)，留香時(shí)間長(zhǎng)，此時(shí)酸價(jià)為1.70 m g/g。當(dāng)酶解時(shí)間超過(guò)2 h后，酸價(jià)繼續(xù)上升，開(kāi)始出現(xiàn)酸敗味，感官評(píng)分下降，可能是黃油的酶解程度過(guò)高導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中不良風(fēng)味物質(zhì)生成。綜合考慮，選擇酶解最適宜的時(shí)間為2 h。

2.3 共固定化酶的酶解溫度對(duì)奶香基料品質(zhì)的影響

酶對(duì)溫度較為敏感,溫度的不同會(huì)影響到酶活性中心的分子構(gòu)象分布及底物黃油的乳化狀態(tài)，從而影響到整個(gè)酶解反應(yīng)的進(jìn)程。當(dāng)酶解溫度低于最適溫度時(shí)，溫度會(huì)抑制酶的活性，使酶活力較低，同時(shí)也會(huì)影響底物的黏度，進(jìn)而影響傳質(zhì)速度，酶解反應(yīng)的速度變慢。當(dāng)酶解溫度高于最適溫度時(shí)，由于高溫會(huì)導(dǎo)致酶變性而減弱甚至失去催化活性[9]，而且在較高溫度下共固定化酶外層的海藻酸鈣會(huì)軟化，使包埋在其中的酶泄漏出來(lái)，酶活力下降。

圖3 共固定化酶的酶解溫度對(duì)酸價(jià)和感官評(píng)分的影響

表4 酶解溫度對(duì)奶香基料的感官影響

由圖3和表4可以看見(jiàn)，當(dāng)酶解溫度低于40℃時(shí)，隨著溫度的升高，奶香香基的香氣越來(lái)越強(qiáng)烈，香氣純度越來(lái)越協(xié)調(diào)、豐富，原因可能是溫度的升高促進(jìn)了酶解反應(yīng)的進(jìn)行，風(fēng)味產(chǎn)物也隨之增加。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，所得到的奶香香基的感官評(píng)分最高，此時(shí)的香基奶香是偏奶酪的奶香，奶香較強(qiáng)，香氣較純正圓潤(rùn)，留香時(shí)間長(zhǎng)，所測(cè)得酸價(jià)是1.58 m g/g。當(dāng)酶解溫度達(dá)到45℃時(shí)，酶解產(chǎn)物的酸價(jià)最高，酸價(jià)是3.58 m g/g，感官評(píng)分降低，可能是因?yàn)槊附膺^(guò)度產(chǎn)生不良風(fēng)味物質(zhì)。酶解溫度超過(guò)45℃時(shí)，可能是由于酶解溫度高于最適溫度導(dǎo)致酶變性而減弱甚至失去催化活性，或者是因?yàn)楣补潭ɑ竿鈱拥暮Ｔ逅徕}因?yàn)闇囟鹊纳叨浕?，使包埋在其中的酶泄漏出?lái)，使酶活力開(kāi)始下降導(dǎo)致酸價(jià)和感官評(píng)分降低。綜上所述，適宜酶解溫度是40℃。

2.4 奶香基料的應(yīng)用試驗(yàn)

為了檢測(cè)所制備的奶香基料的耐熱性、和持香性，將奶香基料應(yīng)用于餅干。

表5 餅干應(yīng)用試驗(yàn)

如表5所示，不添加奶香基料的餅干，味道較單調(diào)，吃起來(lái)只有面粉味；而添加了奶香基料的餅干，能品嘗到較明顯的類(lèi)似奶酪的奶香味，奶香濃郁，更能引起人的食欲，且餅干放置一周后仍帶有奶香味。

可見(jiàn)，所制備的奶香基料不僅奶香濃郁，還具有良好的耐熱性和持香性。

2.5 游離酶與共固定化酶制備奶香基料的比較

雖然固定化酶技術(shù)解決了游離酶的生產(chǎn)成本高等問(wèn)題，但由于酶分子從游離態(tài)變成牢固態(tài)結(jié)合于載體時(shí)，酶分子的微觀環(huán)境發(fā)生了變化[10]。因此游離酶和共固定化酶制備的奶香基料在工藝條件和感官評(píng)分方面還是存在一些差別。

表6 游離酶與共固定化酶制備奶香基料的條件比較

由表6可知，采用游離酶和共固定化酶所制備的奶香基料的香型都是奶酪香，香氣醇正圓潤(rùn)，留香時(shí)間長(zhǎng)，利用共固定化酶所得的奶香基料的香氣濃度稍遜一籌，可能是海藻酸鈉凝膠顆粒在一定程度上妨礙了酶和底物的接觸，使某些呈味物質(zhì)生成較少或無(wú)法生成，造成香氣強(qiáng)度稍弱。但是共固定化酶的酶解時(shí)間更短，而且還可重復(fù)使用，大大節(jié)約了時(shí)間成本和原材料成本。

3 結(jié)論

本研究將蛋白酶M SD、脂肪酶A12K和脂肪酶M ER進(jìn)行共固定化得到共固定化酶，并利用其水解黃油制備奶香基料，結(jié)果表明，共固定化酶的添加量與底物黃油的質(zhì)量比為1∶1，酶解時(shí)間是2 h，酶解溫度是40℃，所得奶香基料奶味濃郁，具有良好的耐熱性和持香性。

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