郭家鼎，郝 佳，李夢榮，王譽程，劉二偉

中藥補骨脂為豆科植物（Psocalea corylicolia L．）的果實，具有補腎壯骨、升達脾胃、納氣止瀉的功效，其主要藥效成分是香豆素類化合物補骨脂素、異補骨脂素及其對應(yīng)的糖苷類化合物補骨脂苷（PO）、異補骨脂苷（IPO），文獻報道補骨脂原藥材中PO、IPO的含量高于補骨脂素、異補骨脂素[1]。血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，可與許多內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合[2]。開展藥物與血漿蛋白相互作用研究是每個藥物開發(fā)過程中必須進行的研究工作。牛血清白蛋白（BSA）與人血清白蛋白（HSA）具有極好的結(jié)構(gòu)相似性，且前者易于獲取和具有高度穩(wěn)定性[3]，所以在研究中常作為HSA的替代品。補骨脂素、異補骨脂素與血漿蛋白結(jié)合的研究已有相關(guān)報道[4]，但其糖苷類化合物PO、IPO的相應(yīng)研究還未見報道。本文利用紫外吸收光譜法和熒光光譜法首次研究PO和IPO與BSA的相互作用，為補骨脂的安全應(yīng)用提供實驗支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 熒光分光光度計（F-7000，日立高新技術(shù)有限公司）；超級恒溫水浴箱（天津歐諾儀器有限公司）；紫外檢測器（Agilient 1260高效液相色譜儀）；十萬分之一天平（瑞士 Mettler Toledo公司，AX-205）；超純水制造機（Millipore公司，Mill-QⅡ型）。

1.2 試劑 PO，IPO（天津西瑪科技有限公司）；布洛芬Ibu、BSA、磷酸鹽緩沖液PBS（索萊寶科技有限公司）；華法林鈉War（天津渤爾特科技有限公司）；8-苯胺基-1-萘磺酸鈉ANS-Na（梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；其他試劑均為分析純，實驗用水均為超純化水。

2 實驗方法

2.1 儲備溶液配制 以PBS緩沖溶液（pH 7．4溶劑配制 1．0×10-4mol/L的 BSA標準溶液備用，PO和IPO配成1×10-2mol/L標準液備用，均在0～4℃冰箱中保存。

2.2 紫外光譜研究 移取100 μL 1．0×10-3mol/L藥物溶液、一定量的BSA溶液于1．5 mL離心管中，以PBS緩沖溶液（pH 7．40）定容至1 mL，掃描得到190～400 nm紫外吸收光譜。

2.3 熒光光譜研究

2.3.1 熒光淬滅光譜 移取100 μL 5．0×10-5mol/L BSA溶液和一定量的PO與IPO溶液于1．5 mL離心管中，以pH 7．40的PBS緩沖溶稀釋至1 mL，得到不同濃度的PO和IPO待測溶液，其濃度從1到8 依次是 0、0．2、0．5、1、1．5、2、2．5、3×10-4mol/L。實驗過程中，為了避免內(nèi)濾光效應(yīng)，使BSA的終濃度為5×10-6mol/L。工作液至于37℃水浴中溫育1 h，分取樣品100 μL至于96孔板中，制備4個復(fù)孔。激發(fā)波長278 nm，進行300～500 nm的全波長掃描，激發(fā)波長和發(fā)射波長的狹縫分別是5 nm，掃描速度240 nm/min。記錄樣品在37℃條件下的熒光發(fā)射光譜。

2.3.2 同步熒光掃描圖譜 以240 nm為激發(fā)波長，300 nm為發(fā)射波長（Δλ=60 nm），測定加入藥物后體系的同步熒光光譜。藥物濃度濃度從1到8依次是 0、0．2、0．5、1、1．5、2、2．5、3×10－4mol/L。

2.3.3 三維熒光掃描圖譜 激發(fā)波長的范圍240～320 nm；發(fā)射波長范圍300～450 nm，其他參數(shù)同熒光發(fā)射光譜。

2.3.4 位點競爭實驗 固定BSA的濃度，向藥物-BSA體系分別加入一定量的競爭試劑：位點Ⅰ（SiteⅠ）的探針試劑為War，位點Ⅱ（SiteⅡ）的探針試劑為Ibu，在激發(fā)波長為278 nm，發(fā)射波長為340 nm處測定其熒光強度，所得數(shù)據(jù)用來計算藥物與BSA結(jié)合常數(shù)。

2.3.5 疏水探針ANS 結(jié)合研究：實驗（1），將PO/IPO 加入到 BSA-ANS-Na（CBSA：CANS-Na=1∶1）體系中，PO/IPO 濃度變化范圍為 0～3×10－4mol/L，設(shè)置激發(fā)波長為375 nm，記錄ANS-Na在最大發(fā)射波長465 nm處的熒光值；實驗（2），將PO/IPO加入到BSA-ANS-Na（CBSA：CANS-Na=1∶1）體系中，PO/IPO 濃度變化范圍為 0～3×10－4mol/L，設(shè)置激發(fā)波長為 278nm，記錄BSA在最大發(fā)射波長340 nm處的熒光值，所得數(shù)據(jù)用來計算藥物與BSA鍵合常數(shù)。

3 結(jié)果

圖1 PO（A）和IPO（B）對BSA的紫外吸收圖譜Fig.1 UV/vis absorbance spectra of PO(A)or IPO(B)in the absence and presence of BSA

3.1 紫外/可見吸收光譜研究 紫外/可見吸收光譜法方法簡單適用于探索結(jié)構(gòu)變化和了解復(fù)合物的形成[5]。通過預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，當固定BSA的濃度，不斷增加藥物濃度時，在BSA最大吸收波長處有干擾，因此為了考察PO、IPO與BSA相互作用，實驗固定藥物濃度，測試不同濃度BSA與一定量的藥物作用的紫外/可見吸收光譜。如圖1所示，隨著BSA濃度的增加，藥物的紫外吸收光譜呈現(xiàn)了增色效應(yīng)，提示可能是因為二者發(fā)生了相互作用，導(dǎo)致了BSA構(gòu)像發(fā)生變化。但是藥物和BSA相互作用機制還需要進一步探討，因此，進行了熒光光譜研究。

3.2 PO和IPO對BSA的淬滅作用及其結(jié)合常數(shù)研究 如圖2A所示，當激發(fā)光波長為278 nm時，BSA熒光發(fā)射峰位置在339 nm附近，且PBS緩沖液及兩種藥物在339 nm附近無明顯的熒光發(fā)射，對實驗不造成干擾。本實驗以PBS作為參比溶液，采用背景扣除法修正參比溶液的背景熒光得到如圖2B-C熒光淬滅圖譜。由圖2B-C可知，固定BSA的濃度不變，隨著PO和IPO濃度的增加，BSA熒光強度逐漸下降，最大發(fā)射波長發(fā)生了約2 nm的輕微紅移，說明PO和IPO對BSA具有明顯的熒光淬滅作用。又如圖2B-C所示，PO和IPO對BSA的熒光淬滅圖譜中均出現(xiàn)了等發(fā)射點，表明PO和IPO與BSA的相互作用過程中產(chǎn)生了新的化合物，導(dǎo)致其對BSA的熒光淬滅行為。

熒光淬滅作用分為動態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，無論是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，全部遵循Stern－Volmer方程[12]：

由Stern-Volmer方程擬合得到的圖3顯示，在一定的藥物濃度范圍內(nèi)（0-3×10-4mol/L），F(xiàn)0/F與[D]線性關(guān)系良好，且由表1可知，37℃時，PO和IPO對BSA熒光淬滅速率常數(shù)均為3．1×1011L/（mol·s），大于各類熒光淬滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)2．0×1010L/（mol·s），說明PO和IPO對BSA的熒光淬滅是因為新的結(jié)合物生成而引起，即靜態(tài)淬滅，這與上述熒光淬滅圖譜的結(jié)果一致。

圖2 BSA熒光圖譜（A）及PO（B）、IPO（C）對BSA的熒光淬滅圖Fig.2 Fluorescence spectra of BSA in the absence(A)and presence of PO(B)or IPO(C)

靜態(tài)淬滅過程也可以用修正的Stern-Volmer方程分析[6]，

根據(jù)方程（2）擬合得到線性方程F0/（F0－F）～1/[D]，見圖4。由截距和斜率計算得到37℃時PO和IPO對BSA的結(jié)合常數(shù)Ka，詳見表1。

藥物在BSA上結(jié)合位點數(shù)的推算多采用修正后的Scatchard方程[7]，圖5為利用lg[（F0-F）/F]～lg[D]作圖得到的藥物-BSA體系的Scatchard圖：

由圖5的直線斜率計算得到37℃時藥物分子在BSA上的結(jié)合位點數(shù)n并列于表1中。PO和IPO在在BSA上的結(jié)合位點數(shù)分別是1．11和0．94，說明藥物在BSA上只存在一個結(jié)合位點，即藥物與BSA以1∶1的比例進行結(jié)合。

3.3 PO和IPO對BSA位點確定研究 HSA上至少有兩個特異的高親和藥物結(jié)合位點，分別稱為siteⅠ和siteⅡ。許多藥物對HSA的結(jié)合具有特異性[8]，如War結(jié)合于siteⅠ，Ibu結(jié)合于siteⅡ，這兩個藥物可以用作位置探針。BSA與HSA結(jié)構(gòu)上有極高的相似度，因此，選擇 War、Ibu 分別作為 siteⅠ、siteⅡ的探針藥物，從而研究探針藥物與PO和IPO的競爭結(jié)合情況，確定藥物在BSA上的結(jié)合位點。本實驗中，探針藥物與BSA按1∶1比例混合，同時加入到含有不同濃度的藥物溶液中。在3種探針藥物存在下，根據(jù)方程（2）分析熒光淬滅數(shù)據(jù)，相關(guān)熒光參數(shù)列于表1。根據(jù)方程（3）所得的結(jié)合位點n約為1，說明探針藥物的存在并沒有改變PO和IPO在BSA上結(jié)合位點數(shù)，證實了上述PO和IPO在BSA上均有一個結(jié)合位點的結(jié)論。由表1可知，探針I(yè)bu存在時，IPO對BSA的結(jié)合常數(shù)Ka變小幅度最大，表明Ibu與IPO同時競爭同一個結(jié)合位點，但是探針試劑的加入并沒有對PO的結(jié)合常數(shù)造成影響。

圖3 PO（A）和IPO（B）對BSA的Stern-Volmer擬合圖Fig.3 Stern-Volmer curve of BSA fluorescence quenching treated with different concentrations of PO(A)or IPO(B)

圖 4 PO（A）和 IPO（B）對 BSA 的 F0/(F0-F)～1/[D]擬合圖Fig.4 Plot of F0/(F0-F)versus 1/[D]for fluorescence quenching of BSA by PO(A)or IPO(B)

圖 5 PO（A）和 IPO（B）對 BSA 的 lg[F0-F)/F]～lg[D]擬合圖Fig.5 Plot of lg[F0-F)/F]versus lg[D]for quenching process of PO(A)or IPO(B)with BSA

表1 藥物-BSA體系及藥物-BSA/探針體系在PBS緩沖液（pH=7.4）中和T=37℃條件下的熒光參數(shù)Tab.1 Fluorescence parameters of drug-BSA system and Drug-BSA/probeSysteminPBSbuffer(pH=7.4)andT=37℃

3.4 ANS置換探針 ANS在極性環(huán)境中沒有明顯的熒光發(fā)射，但是與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域結(jié)合后熒光信號增強[8]，所以本實驗選用疏水性探針試劑ANSNa研究BSA與PO/IPO之間相互作用的性質(zhì)。在實驗（1）中，將不同濃度的PO/IPO加入到BSA-ANS體系，藥物濃度變化范圍0～3×10-4mol/L，記錄ANS相對熒光強度F/F0（F0：未加藥物時ANS熒光值，F(xiàn)：加入不同濃度藥物時ANS熒光值）隨藥物濃度變化趨勢，得圖6，如圖所示隨著藥物濃度的增加ANS熒光值變小。ANS是一個廣譜性熒光探針，在BSA上有5個結(jié)合位點，但是當ANS與BSA濃度比為1∶1時，其主要結(jié)合位點主要位于SiteⅡ[9]，因此推測PO/IPO與ANS競爭性結(jié)合BSA致使ANS熒光強度下降。利用ANS進行了第二系列實驗，ANS對PO/IPO與BSA結(jié)合常數(shù)的影響結(jié)果列于表1，發(fā)現(xiàn)ANS使PO/IPO結(jié)合常數(shù)Ka變小，再一次對PO/IPO在BSA上的結(jié)合位點是SiteⅡ的結(jié)果進行了驗證。

3.5 PO和IPO對BSA構(gòu)象影響研究 使用同步熒光光譜可以探測蛋白質(zhì)氨基酸微環(huán)境的改變，而血清白蛋白的熒光發(fā)射的特性主要來自色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）的貢獻，其中Trp熒光強度最大，因此Trp的熒光猝滅可以用來表征藥物與BSA的結(jié)合關(guān)系及BSA形態(tài)的變化[10]。本實驗把Trp的同步熒光光譜作為定性判斷BSA構(gòu)象變化的依據(jù)，見圖 7。當 Δλ=λem-λex=60 nm時，同步熒光顯示為Trp的熒光行為。如圖7所示，固定BSA的濃度不變，隨著藥物濃度的增加，BSA的熒光強度逐漸下降，最大發(fā)射波長發(fā)生了約3 nm的輕微紅移，表明藥物對BSA的構(gòu)象造成了輕微的影響，使Trp所處的微環(huán)境極性略有增加。

三維熒光圖譜可以同時改變發(fā)射波長和激發(fā)波長，從而提供熒光體的熒光特性信息[11]。圖8為BSA、PO-BSA和IPO-BSA的三維熒光圖譜。如圖8所示，峰1主要是tyr和try熒光發(fā)射行為，隨著PO和IPO的加入，峰1的熒光值下降，表明tyr和try的微環(huán)境發(fā)生了變化，PO和IPO與BSA之間的相互作用導(dǎo)致BSA構(gòu)象發(fā)生了變化，這與同步熒光發(fā)射圖譜顯示的結(jié)果一致。

圖6 疏水熒光探針ANS在PO/IPO作用下的相對熒光圖譜Fig.6 Displacement of fluorescent probes from HSA by drugs(PO/IPO)

4 討論

本實驗采用紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法對PO和IPO在生理狀態(tài)下對BSA的熒光淬滅方式、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、以及PO和IPO對BSA構(gòu)象的影響進行了研究。從熒光淬滅光譜、同步熒光光譜及三維熒光光譜可以看出，PO和IPO對BSA產(chǎn)生靜態(tài)淬滅作用，并且對BSA的構(gòu)象產(chǎn)生了輕微影響。根據(jù)表1結(jié)果可知，PO和IPO對BSA之間有較弱的結(jié)合。根據(jù)位點競爭實驗結(jié)果可知，PO和IPO的在BSA上的主要結(jié)合位點在SiteⅡ。

圖7 PO（A）和IPO（B）對BSA同步熒光光譜圖Fig.7 Influence of PO(A)or IPO(B)on synchronous fluorescence spectra of BSA

圖 8BSA（A）、PO-BSA（B）和 IPO-BSA（C）的三維熒光圖譜Fig.8 Three-dimensional fuorescence spectra of BSA in the absence(A)and presence of PO(A)or IPO(B)

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