廉 富，蘇景深，劉恩順，鄭 莉，趙鑫民，陳善夫

急性肺損傷（ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種炎癥反應(yīng)，多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子參與發(fā)病，失控的炎癥反應(yīng)損傷肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺水清除能力下降，肺含水量增加，形成肺水腫,氣體交換障礙,從而導(dǎo)致嚴(yán)重低氧血癥[1]。水通道蛋白（AQPs）是一組在哺乳動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)的水選擇通道的分子家族，可以增強(qiáng)漿膜面水通透力的功能，因而可以提供快速液體轉(zhuǎn)運(yùn)的通路[2]。肺上皮細(xì)胞鈉通道（ENaC）由α、β和γ 3個(gè)亞型組成，廣泛分布于肺Ⅰ型[3]和Ⅱ型[4]上皮細(xì)胞，是肺泡腔水腫液清除（AFC）的關(guān)鍵作用環(huán)節(jié)。本研究探討了內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠模型中AQP1和a-ENaC蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)及通腑瀉肺中藥干預(yù)的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康SD大鼠27只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXX（京）2012－0001），購入后置天津工程所實(shí)驗(yàn)中心常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2 藥物及試劑 通腑瀉肺方（葶藶子、桑白皮、大黃、枳實(shí)、厚樸）中藥顆粒劑，購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥房。大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖購自Sigma公司。AQP1抗體購自Abcam公司，批號：Ab11025；a-ENaC抗體購自Proteintech公司，10924-2-AP。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

2 方法

2.1 ALI/ARDS模型的建立及分組給藥 動(dòng)物購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥組，每組9只。模型組與中藥組于左側(cè)尾靜脈注射內(nèi)毒素8 mg/kg，復(fù)制ALI/ARDS模型。正常對照組大鼠靜脈注射生理鹽水。對照組與模型組在造模完成后即用生理鹽水灌服，每次0.01 mL/g。治療組在造模完成后給予通腑瀉肺中藥灌胃，每次0.01 mL/g，每日1次，共7 d。

2.2 鏡下觀察 給藥1周后，取右肺下葉，應(yīng)用10%甲醛溶液進(jìn)行固定，常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色檢測。光鏡下觀察，比較分析各組大鼠肺組織病理學(xué)改變。

2.3 免疫組化染色方法檢測檢測肺組織AQP1和a-ENaC的表達(dá) 將組織切片行脫蠟、水化處理后，高壓修復(fù)抗原，用3%過氧化氫溶液消除內(nèi)源性過氧化酶，血清封閉后各組切片分別加入兔源性AQP-1、a-ENaC多克隆抗體（均為1∶100稀釋），4℃過夜后加入兔二抗，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，光鏡下觀察。AQP-1、a-ENaC的陽性反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕黃色。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野、拍照，代表該動(dòng)物肺組織AQP-1、a-ENaC的蛋白表達(dá)強(qiáng)度。應(yīng)用Image-Pro Plus6．0軟件分析陽性細(xì)胞數(shù)，同時(shí)將空白對照組陽性細(xì)胞率設(shè)置為100%，計(jì)算其他組別的陽性細(xì)胞率，并對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗(yàn)，P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 空白組大鼠肺組織光鏡下可見大部分肺泡結(jié)構(gòu)正常、充盈良好，無肺泡萎陷；少部分肺泡間隔增寬、充血、少量淋巴細(xì)胞浸潤，未見肺泡萎陷；灶性肺間質(zhì)、細(xì)支氣管周少量淋巴細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肺組織光鏡下可見廣泛肺泡萎陷，肺泡間隔增寬、充血、較多淋巴、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，局部呈實(shí)性。部分肺泡腔可見少量紅細(xì)胞、淋巴、中性粒及巨噬細(xì)胞滲出；部分細(xì)支氣管及終末細(xì)支氣管周可見大量淋巴細(xì)胞浸潤、淋巴組織增生。中藥組大鼠肺組織鏡下大部分肺泡結(jié)構(gòu)正常、充盈良好，無肺泡萎陷；部分肺泡間隔增寬、充血、纖維組織增生，較多淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，可見肺泡萎陷；偶見細(xì)支氣管周灶性淋巴細(xì)胞浸潤，見圖1。

圖1 大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變(SP,×100)Fig.1 Histology changes of lung in rats(SP,×100)

3.2 AQP1和a-ENaC在肺組織的分布及表達(dá)情況 空白組大鼠肺組織中AQP1和a-ENaC均呈高水平表達(dá)，AQP1主要分布在肺組織微血管的內(nèi)皮細(xì)胞膜，以及少部分分布在肺上皮細(xì)胞膜，見圖2。a-ENaC主要分布在肺泡細(xì)胞膜，見圖3。與空白組比較，模型組可見 AQP1 表達(dá)顯著下降（P＜0．01）；中藥組經(jīng)過治療干預(yù)后，AQP1表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0．05）。與空白組比較，模型組可見a-ENaC 表達(dá)顯著下降（P＜0．01）；中藥組經(jīng)過治療干預(yù)后，a-ENaC 表達(dá)增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。見表1。

圖2 AQP1在肺組織的分布與表達(dá)(SP,×400)Fig.2 Distribution and expression of AQP1 in lung tissue(SP,×400)

圖3 a-ENaC在肺組織的分布及表達(dá)(SP,×400)Fig.3 Distribution and expression of a-ENaC in lung tissue(SP,×400)

表1 大鼠肺組織AQP-1、a-ENaC免疫組織化學(xué)表達(dá)的平均光密度值（x±s）Tab.1 The mean optical density of AQP-1 and a-ENaC in lung tissue of rats（x±s）

4 討論

ALI/ARDS狀態(tài)下肺微血管的通透性增高，肺泡上皮受損，導(dǎo)致大量血管內(nèi)液滲透到肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)，引起肺泡內(nèi)及肺間質(zhì)大量肺水形成的高通透性水腫[5]。研究發(fā)現(xiàn)的AQPs包括AQP 0～12共13種亞型。其中，AQP-1主要分布于微血管內(nèi)皮細(xì)胞、支氣管周圍血管床、氣管黏膜、淋巴管、胸膜和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞[6]。敲除AQP1基因的小鼠肺泡毛細(xì)血管通透性較野生型發(fā)生顯著改變，肺泡毛細(xì)血管膜屏障通透性下降10倍左右[7]。ENaC通過主動(dòng)吸收肺泡腔內(nèi)的鈉離子實(shí)現(xiàn)的肺泡液體吸收主要途徑,是肺水腫清除的決定因素[8]。ENaC主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)將肺泡腔內(nèi)的鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)入肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)，隨后位于基底膜的鈉/鉀ATP酶再將鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)至肺間質(zhì)，其中主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為肺水腫液清除提供了源動(dòng)力，將肺水腫液體繼發(fā)性主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)至間質(zhì)，并通過靜脈和淋巴回流，從而減輕肺水腫。整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中90%的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)阻力存在于ENaC中，因此ENaC是肺泡腔內(nèi)鈉水重吸收的限速步驟[9]。a-ENaC基因敲除小鼠因肺水腫液清除能力低下而在出生后死于ARDS[10]。

通腑瀉肺方藥源自中醫(yī)學(xué)“肺與大腸相表里”理論，肺與大腸通過經(jīng)脈相連，兩者在生理功能上相互協(xié)調(diào)，而在發(fā)生病理變化時(shí)又相互影響。通腑用小承氣湯，方中大黃具有破積聚、蕩滌胃腸等功效。厚樸行氣散滿，枳實(shí)破氣消痞，諸藥合用，可以輕下熱結(jié)，除滿消痞。瀉肺用葶藶子，性大寒，味辛、苦，歸肺、膀胱經(jīng)，功能瀉肺平喘，行水消腫；桑白皮，甘寒入肺，功能瀉肺平喘，利水消腫。上述兩者合用為通腑瀉肺方，既可瀉肺平喘，又能通腑瀉熱，肺腸同治。前期研究發(fā)現(xiàn)通腑瀉肺方可以明顯減輕ALI/ARDS大鼠炎癥因子水平的表達(dá)，減輕肺部的炎癥反應(yīng)[11-12]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通腑瀉肺中藥組肺組織病理損傷減輕，免疫組化方法檢測發(fā)現(xiàn)其可上調(diào)肺組織AQP1和a-ENaC表達(dá)。提示通腑瀉肺中藥減輕ALI/ARDS大鼠肺水腫的機(jī)制可能在于其提高AQP1和a-ENaC表達(dá)，促進(jìn)肺水腫的吸收，為臨床治療提供了新思路。

[1]Huang B，Wang DX，Deng W.Protective effects of dexamethasoneon early acute lung injury induced by oleic acid in rats[J].Int J Clin ExpMed，2014，7（12）：4698-4709.

[2] Borgnia M，Nielsen S，Engel A，et al．Cellular and molecularbiology of the Aquaporin water channel[J].Annu RevBiochem，1999，68:425-458．

[3] Borok Z，Liebler JM，Lubman RL，et al．Na transportproteins are expressed by rat alveolar epithelial type I cells[J]．Am J Physiol Lung Cell Mol Physio，2002，282(4):L599-L608．

[4] Talbot CL，Bosworth DG，Briley EL，et al． Quantitationand localization of ENa C subunit expression in fetal，new-born，and adultmouselung[J]．AmJRespirCellMolBi-ol，1999，20(3):398-406．

[5] Johnson ER，Matthay MA．Acute lung injury:epi-demiology，pathogenesis，and treatment[J]．J Aerosol MedPulm Drug Deliv，2010,23(4):243．

[6] Ablimit A，Hasan B，Lu W，et al.Changes in waterchannel aquaporin 1 and aquaporin 5 in the smallairways and the alveoli in a rat asthma model[J].Micron，2013，45：68-73.

[7] Bai C，F(xiàn)ukuda N，Song Y，et al.Lung fluid transport in aquapor－in-1 and aquaporin-4 knockout mice[J].J Clin Invest，1999，103（4）：555-561.

[8] Matalon S，O’Brodovich H．Sodium channels in alveolarepithelial cells: molecular characterization， biophysicalproperties，and physiological significance[J]．Annu RevPhysiol，1999，61:627-661．

[9] Chen HI,Yeh DY,Liou HL,et al.Insulin attenuates endotoxininduced acute lung injury in conscious rats[J].Crit Care Med.2006,34(3):758-764.

[10]Hummler E，Barker P，Gatzy J，et al．Early death due todefective neonatal lung liquid clearance in alpha-ENa C-de-ficient mice[J]．Nat Genet，1996，12(3):325-328．

[11]楊英偉,劉恩順.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中醫(yī)病因病機(jī)及辨證分型的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)雜志,2013,56(9):1937-1939.

[12]劉恩順,孫增濤,蘇景深,等.急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征肺腸相關(guān)證候特征及其演變的臨床調(diào)查[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(10):3125-3127.