苑珍珍 ，楊 召 ，金鴻賓 ，許海委

椎間盤退變是引起頸腰部疾患的前提和基礎(chǔ)。有統(tǒng)計顯示，世界上一半以上的人口會受到頸腰痛的困擾[1]。椎間盤連接上下兩個椎體，是維持脊柱結(jié)構(gòu)與功能的重要組成部分。髓核細胞是構(gòu)成椎間盤的主要成分，可以合成和分泌細胞外基質(zhì)，在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要作用。骨碎補是治療腎虛腰痛的常用藥，具有補腎壯骨，活血止痛的作用。柚皮苷作為其主要組成單體，研究顯示其具有抑制髓核細胞退變的作用，但作用機制報道較少[2]。本實驗選取Fas/FasL通路，觀察柚皮苷對人退變椎間盤髓核細胞凋亡的影響，進一步闡明其可能的機制。

1 材料與方法

1．1 組織來源 人退變椎間盤髓核組織取自1例因椎間盤突出行椎間盤切除手術(shù)的患者，年齡50歲。術(shù)前取得患者同意，并簽署知情同意書。取材時嚴格無菌操作，取材后1h內(nèi)細胞室內(nèi)進行髓核細胞分離培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國），乙二胺乙酸二鈉（EDTA）（Sigma公司，美國），胎牛血清（GIBCO公司，美國），甲苯胺藍溶液（北京東勝泰博科技有限公司，北京）；CO2培養(yǎng)箱（Hera-cell公司，德國），恒溫搖床（Heidolph公司，德國），倒置顯微鏡（OLYMPUS公司，日本），細胞培養(yǎng)板（Corning公司，美國），高通量實時熒光定量聚合酶鏈鎖反應(yīng)（PCR）儀（Roche公司，瑞士），百級層流細胞室（天津醫(yī)院細胞工程室）。

1.3 方法

1.3.1 人退變椎間盤髓核細胞的分離和培養(yǎng) 將髓核組織用含青霉素和不含青霉素的D-Hanks液各沖洗3遍；將髓核組織剪碎，37℃下用0.25%的胰蛋白酶和0.2%的Ⅱ型膠原酶聯(lián)合消化40 min，消化期間一直放置于搖床上，輕輕晃動。收集消化液，1 000 r/min離心5 min，去除上清液。用DMEM/F12培養(yǎng)液吹勻細胞，再次離心，重復(fù)3次。用計數(shù)板進行細胞計數(shù)，按1×106接種于底面積為25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入5 mL含青霉素100 U/mL、10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)液。37℃、體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換液1次，90%融合后用濃度為0.05%的胰酶消化傳代。

1.3.2 髓核細胞的鑒定 番紅O染色：P1代細胞多聚甲醛固定后，1%番紅O染色后，光鏡下觀察細胞分泌蛋白多糖能力。

甲苯胺藍染色：細胞固定后，1%甲苯胺藍染色10 min，磷酸鹽（PBS）緩沖液沖洗，封片，光鏡下觀察細胞分泌糖胺聚糖能力。

1.3.3 噻唑藍（MTT）法選擇柚皮苷抑制人髓核細胞凋亡的最佳濃度 采用MTT法測定不同濃度柚皮苷（0、20、40、80 μg/mL）對髓核細胞凋亡的抑制作用，髓核細胞加入含柚皮苷的培養(yǎng)基72 h后，用MTT實驗檢測柚皮苷對髓核細胞的抑制作用，利用酶標儀在720 nm波長處測定吸光度A，篩選柚皮苷抑制髓核細胞凋亡的最佳濃度，定為實驗組，0 μg/mL柚皮苷為空白對照組。

1.3.4 流式細胞儀測定細胞凋亡率 培養(yǎng)髓核細胞24 h，胰酶消化、計數(shù)、離心、洗滌、棄上清后再離心、重復(fù)洗滌細胞1次，加入5 μL膜聯(lián)蛋白V-FITC混合均勻后，避光孵育15 min后離心洗滌細胞，加入3 μL碘化丙啶混合均勻后，流式細胞儀測定細胞凋亡率。

1.3.5 實時熒光定量PCR檢測Fas、FasL、Caspase-8基因表達情況 實驗組和對照組P3代髓核細胞培養(yǎng)7 d后，常規(guī)消化收集細胞，加入1 mL Trizol試劑，采用相分離技術(shù)提取RNA，紫外分光光度法測定其在280 nm和260 nm處的吸光度，計算RNA濃度和純度（OD260/OD280，正常值為 1．7～2．0）。各組檢測基因反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以GAPDH為內(nèi)參基因，引物（北京奧科鼎盛生物科技有限公司）如表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、PCR擴增體系以及反應(yīng)條件，依據(jù)說明書設(shè)定。反應(yīng)完成后進行擴增曲線和熔解曲線分析?；虮磉_量中檢測基因的初始模板量以2-△△Ct表示。

1.3.6 蛋白免疫印跡法（Western-blot）檢測Fas蛋白 收集髓核細胞，加入RIPA裂解液冰上裂解，細胞裂解后，微孔法測定蛋白濃度，沖洗后加熱，使蛋白變性，上樣、電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫封閉。加入適當(dāng)稀釋的一抗（Fas 1∶200，F(xiàn)asL 1∶100，Caspase-8 1∶100）,室溫下反應(yīng)1 h。加入相應(yīng)二抗，漂洗后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20．0統(tǒng)計軟件包進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0．05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 髓核細胞培養(yǎng)以及形態(tài)觀察 原代髓核細胞7 d后基本貼壁,細胞呈梭形。15 d后，細胞進入對數(shù)生長期，見圖1。

圖1 接種7 d后的細胞Fig.1 Cells inoculated for 7 days(×200)

2.2 髓核細胞的鑒定 番紅-O染色和甲苯胺藍染色均為陽性，表明細胞可以分泌蛋白多糖和糖胺多糖，見圖 2、圖 3。

圖2 髓核細胞番紅-O染色(×200)Fig.2 Red-O staining of nucleus pulposus cells(×200)

圖3 髓核細胞甲苯胺藍化學(xué)染色(×200)Fig.3 Toluidinebluestainingofnucleuspulposuscells(×200)

表 1 Fas、FasL、Caspase-8、GAPDH 基因引物Tab.1 Fas、FasL、Caspase-8、GAPDH primer

2.3 MTT法檢測柚皮苷抑制人髓核細胞凋亡的最佳濃度 對照組吸光度為（0．26±0．02），與對照組相比，20 μg/mL柚皮苷組吸光度明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），而 40、80 μg/mL 柚皮苷組無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。與20μg/mL柚皮苷組比較，40、80μg/mL柚皮苷組吸光度明顯降低（P＜0．01）。80 μg/mL 柚皮苷組吸光度值無明顯差異（P＞0．05)。見表2。

表2 MTT法檢測柚皮苷抑制人髓核細胞凋亡（x±s）Tab.2 MTT assay of naringin to inhibit the apoptosis of human nucleus pulposus cells（x±s）

2.4 流式細胞儀測定細胞凋亡率 對照組細胞凋亡率為（12．48±1．38）%，加入不同濃度柚皮苷后，凋亡率均下降，與對照組相比，20、40 μg/mL柚皮苷組抑制細胞凋亡具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），其中20 μg/mL 柚皮苷對細胞凋亡抑制最明顯（P＜0．01），與 20 μg/mL 柚皮苷組比較，40、80 μg/mL 柚皮苷組細胞凋亡率較高（P＜0．01）。另外，40 μg/mL 柚皮苷組優(yōu)于 80 μg/ml柚皮苷組（P＜0．05），見表 3、圖 4。根據(jù)MTT與流式細胞的篩選結(jié)果采用20 μg/mL的柚皮苷，定為實驗組進行后續(xù)實驗研究。

表3 對照組與不同濃度柚皮苷組抑制人退變髓核細胞凋亡率（x±s）Tab.3 Control group and naringin group with different concentrations inhibit the apoptosis rate of human degeneration nucleus pulposus cells（x±s）

2.5 qRT－PCR 檢測 Fas、FasL、Caspase-8 基因表達情況 20 μg/mL柚皮苷組比對照組可以明顯抑制Fas、FasL、Caspase-8 基因的表達（P＜0．01）。柚皮苷組與對照組對于各個基因表達的影響，見表4。

3 討論

圖4 各組抑制人退變髓核細胞凋亡的流式細胞圖片F(xiàn)ig.4 Flow cytometry in each group to inhibit the apoptosis of degenerative nucleus pulposus cells

圖 5 Western-blot檢測 Fas、FasL、Caspase-8 蛋白表達Fig.5 Western-blot detection of Fas,FasL and Caspase-8 protein expression

表4 qRT-PCR檢測相關(guān)凋亡基因（x±s）Tab.4 qRT-PCR detection of related apoptotic genes（x±s）

腰椎間盤髓核組織主要由髓核細胞、蛋白多糖、糖胺多糖Ⅰ、Ⅰ型和Ⅱ型膠原及水分構(gòu)成。成人髓核細胞為類軟骨細胞，主要分泌蛋白多糖、糖胺多糖、Ⅱ型膠原等細胞外基質(zhì)[3]。隨著髓核細胞凋亡增加，細胞外基質(zhì)含量下降，水分減少，椎間盤退變趨勢明顯增加。而細胞外基質(zhì)的減少會進一步加劇髓核細胞的凋亡，形成惡性循環(huán)，腰椎間盤退變?nèi)遮吋又豙4]。本實驗采用人退變椎間盤髓核組織，分離培養(yǎng)其細胞，番紅O染色陽性顯示細胞分泌蛋白多糖，甲苯胺藍染色陽性說明細胞可以分泌Ⅱ型膠原，證明此為髓核類軟骨細胞。

腰椎間盤退變中醫(yī)屬“腰痹”范疇，病機主要為肝腎虧虛，筋脈失養(yǎng)。中藥骨碎補具有補腎壯骨、續(xù)傷止痛的作用，常用于腰椎間盤退變的治療。柚皮苷是黃酮類物質(zhì)，是中藥骨碎補主要單體成分之一，具有抗炎、抗氧化、促進骨形成、抑制骨破壞、促進神經(jīng)細胞再生及修復(fù)等作用[5]。有研究顯示，柚皮苷能有效地促進人退變髓核細胞的增殖，提高細胞活性，這可能與其促進髓核細胞蛋白多糖、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）的表達，抑制腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、SOX6和基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的表達相關(guān)[6-7]。本實驗通過MTT法和流式細胞法檢測20 μg/mL柚皮苷為抑制人髓核細胞凋亡的最佳濃度，與相關(guān)文獻報道一致，并用此濃度柚皮苷進行相關(guān)基因及蛋白檢測。

細胞凋亡，又稱程序化細胞死亡，是由基因調(diào)控的細胞主動死亡過程[8]。其凋亡途徑主要有3條：死亡受體復(fù)合體通路（膜受體通路）、線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。死亡受體通路主要包括TNFR途徑、TRAIL途徑、Fas/FasL途徑。細胞凋亡可能通過Fas/FasL系統(tǒng)觸發(fā)死亡信號復(fù)合體介導(dǎo)途徑實現(xiàn)。死亡受體通路中，F(xiàn)as與FasL結(jié)合后，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體，啟動Caspase-8/Caspase-10，可以通過Bid等細胞因子轉(zhuǎn)導(dǎo)，或直接激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3等，完成細胞凋亡[9-10]。qRT-PCR結(jié)果顯示柚皮苷組可以下調(diào)Fas、FasL、Caspase-8基因表達，Western-blot結(jié)果顯示柚皮苷可以抑制Fas蛋白表達，說明柚皮苷可能通過調(diào)控Fas/FasL死亡受體通路，抑制髓核細胞凋亡。

本實驗結(jié)果顯示，柚皮苷可能通過調(diào)控Fas/FasL死亡受體通路抑制人髓核細胞凋亡，為臨床治療腰痛提供新的途徑。但是柚皮苷抑制髓核細胞凋亡機制較為復(fù)雜，是否還通過其他途徑，需要進一步驗證。相信隨著椎間盤退變研究的逐步深入，對其退變機制認識逐漸深刻，會有更多、更有效的治療手段服務(wù)于廣大患者。

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