□ 石曉麗 段 羚 包頭市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

單核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）（簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，下文以“L.M”表示）是一種常見(jiàn)的土壤細(xì)菌，是李斯特菌中唯一能引起人類(lèi)疾病的細(xì)菌。對(duì)于某些食物（比如乳制品和肉制品），其是一種污染菌，能引起食物變質(zhì)。本文在嚴(yán)格按照GB4789.30-2016中規(guī)定的流程進(jìn)行操作的基礎(chǔ)上，根據(jù)多次陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)、陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)以及能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，總結(jié)出食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢測(cè)的幾個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

用胰酪胨大豆肉湯分別活化菌種編號(hào)為CICC21633的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和菌種編號(hào)為CICC10297的無(wú)害李斯特氏菌。

2 檢驗(yàn)方法

依據(jù)GB4789.30-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》第二法，依據(jù)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)，程序見(jiàn)圖1。

圖1 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)流程

3 檢驗(yàn)步驟

首先，取25.0mL無(wú)菌純牛奶于均質(zhì)袋中，分別吸取已用胰酪胨大豆肉湯活化過(guò)的24 h的菌種編號(hào)為CICC21633的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌和菌種編號(hào)為CICC10297的無(wú)害李斯特氏菌各100 μL加入牛奶中（試樣編號(hào)①），再加225 mL無(wú)添加劑的LB肉湯于均質(zhì)袋中，在排擊式均質(zhì)器中連續(xù)拍擊1 min，制成1:10的均液。

其次，分別再取2份25.0 mL無(wú)菌純牛奶，分別加入菌種編號(hào)為CICC21633的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌100 μL（試樣編號(hào)②）和菌種編號(hào)為CICC10297的無(wú)害李斯特氏菌100 μL（試樣編號(hào)③），再分別加225 mL無(wú)添加劑的LB肉湯于均質(zhì)袋中，在排擊式均質(zhì)器連續(xù)拍擊1 min，分別制成1:10的均液。

最后，將制成的3份1:10均液試樣，經(jīng)過(guò)相同的逐級(jí)稀釋后，每個(gè)稀釋度分別吸取1 mL以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL的接種量分別加入3塊李斯特氏菌顯色平板涂布，在36℃中培養(yǎng)。

4 實(shí)驗(yàn)中的對(duì)比

4.1 培養(yǎng)基配制方式對(duì)比

配制LB1、LB2過(guò)程中，需要加入吖啶黃，但吖啶黃本身會(huì)產(chǎn)生熒光，且較難清洗完全。為避免由于瓶子殘留熒光造成一些需要檢測(cè)熒光反應(yīng)的菌種（比如銅綠假單胞菌、飲用水中的大腸埃希氏菌）出現(xiàn)假陽(yáng)性，所以封裝LB1、LB2的瓶子需要單獨(dú)使用、單獨(dú)存放、標(biāo)記明確，不與其他裝培養(yǎng)基的瓶子混用。

配制單增李斯特氏菌顯色培養(yǎng)基時(shí)，將增補(bǔ)劑分成兩份，進(jìn)行區(qū)別溶解。第一份直接溶解后加入到46℃左右的科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基基礎(chǔ)中，編號(hào)培養(yǎng)基Ⅰ；第二份溶解后用磁力攪拌器快速攪拌均勻（以1 000 rpm攪拌30 min），使其完全溶解，在成為奶油狀的勻質(zhì)溶液后加入到46℃左右的科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基基礎(chǔ)中，編號(hào)培養(yǎng)基Ⅱ。對(duì)比只針對(duì)②試樣的培養(yǎng)后狀態(tài)進(jìn)行，對(duì)比見(jiàn)表1。

由此可得出結(jié)論，增補(bǔ)劑在溶解后必須用磁力攪拌器快速攪拌均勻（1 000 rpm），而且用時(shí)要在30 min以上，使其完全溶解成奶油狀的勻質(zhì)溶液后再加入到46℃左右的科瑪嘉李斯特菌顯色培養(yǎng)基基礎(chǔ)中。

4.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)比

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)比見(jiàn)表2。

由此得出結(jié)論，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于觀察L.M的結(jié)果影響較大。觀察太早，菌落形態(tài)不能完全展現(xiàn)，暈圈不清晰，不容易觀察；觀察太晚，菌落形態(tài)老化，暈圈嚴(yán)重淡化，容易遺漏，甚至誤判。

4.3 純化使用的培養(yǎng)基對(duì)比

純化使用培養(yǎng)基對(duì)比見(jiàn)表3。

由此得出結(jié)論，純化細(xì)菌，TSA不是全能的，對(duì)于L.M來(lái)說(shuō)，還需要加酵母粉，含0.6%酵母成分的TSAYE純化L.M效果顯著。

5 結(jié)語(yǔ)

本次實(shí)驗(yàn)對(duì)L.M進(jìn)行多次的陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)、陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)以及能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對(duì)培養(yǎng)基配制方式、培養(yǎng)時(shí)間、純化使用培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，總結(jié)出食品檢驗(yàn)L.M過(guò)程中的幾個(gè)控制點(diǎn)：一是增補(bǔ)劑溶解時(shí)間必須大于30 min；二是選擇觀察結(jié)果的培養(yǎng)時(shí)間要適宜；三是L.M的純化，要選擇配料成分中含有0.6%酵母成分的TSA-YE。

表1 培養(yǎng)基配制方式對(duì)比

表2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)比

表3 純化使用培養(yǎng)基對(duì)比

[1]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB4789.1-2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)總則[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016.

[2]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 4789.30-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016..