李新，劉薇，牛冰，馮燕枝，李慶輝

（河南省鄭州人民醫(yī)院 乳腺外科，河南 鄭州 450003）

乳腺癌是女性健康的頭號殺手，近年來，我國乳腺癌的發(fā)病率逐年遞增，已成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題[1-2]。根據(jù)腫分期和患者的身體狀況，臨床醫(yī)生會選取手術(shù)﹑放化療﹑生物靶向治療﹑內(nèi)分泌治療等多種方案[3]。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase Ⅸ，CAⅨ）是人類碳酸酐酶家族中的一種，作為一種跨膜蛋白，CAⅨ在除胃和膀胱外的大多數(shù)正常組織中并不存在，卻大量表達于腫瘤細胞中。CAⅨ是一種具有一定特異性的腫瘤標志物和潛在的治療靶點，有學者已經(jīng)在肺部和腎臟腫瘤治療領(lǐng)域有初步探索[4-5]。本研究探討CAⅨ蛋白在乳腺癌組織中的表達差異，以及與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，希望為CAⅨ在乳腺癌的診斷治療中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年6月-2016年1月河南省鄭州人民醫(yī)院病理科收集的乳腺癌組織標本120例，其中80例為標準的乳腺良性腫瘤標本。120例組織標本中，年齡37～73歲，平均（51.6±9.4）歲；體重指數(shù)（body mass index, BMI）（23.5±2.0）kg/m2；絕經(jīng) 24例 ；組織學分級：高分化40例，中分化47例，低分化33例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移60例；TNM分期：Ⅰ期22例，Ⅱ期35例，Ⅲ期63例。乳腺良性腫瘤80例，年齡41～76歲，平均（52.8±10.9）歲 ；BMI（23.8±1.9）kg/m2；其中乳腺纖維瘤47例，乳腺囊性增生病22例，乳腺大導(dǎo)管乳頭狀瘤12例，乳房平滑肌瘤9例；絕經(jīng)17例。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準 ①所有乳腺癌患者的診斷以病理學結(jié)果作為標準；②病理組織學類型為浸潤性非特殊癌；③首次診斷或首次手術(shù)治療，未接受任何放化療及免疫治療；④各項臨床資料完整。

1.2.2 排除標準 ①轉(zhuǎn)移性乳腺癌；②既往接受放化療及免疫治療；③伴有甲狀腺功能障礙

1.3 免疫組織化學法

選取乳腺癌組織及乳腺良性腫瘤標本置于多聚甲醛中固定﹑脫水，自來水沖洗后置于梯度酒精中浸泡，使用二甲苯透明2次后于60℃石蠟浸泡包埋3 h，使用石蠟切片機將包埋好的組織連續(xù)切片，厚4μm。石蠟切片放入60℃烤箱30min防脫處理，常規(guī)脫蠟﹑水化并用PBS沖洗3次，組織切片放入抗原修復(fù)液中，然后置于微波爐中行抗原修復(fù)15min，蒸餾水沖洗切片，PBS沖洗3次，0.3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶12min，PBS沖洗3，5min/次，分別將CAⅨ﹑雌激素受體（estrogen receptor, ER）﹑孕激素受體（progesterone receptor, PR）﹑Cerb-2蛋白一抗滴加在切片上，4℃孵化過夜。復(fù)溫后PBS沖洗3次，5min/次，滴加二抗，2.5 h后行DAB染色，并在顯微鏡下仔細觀察切片。蒸餾水沖洗切片，蘇木精復(fù)染，自來水沖洗后使用梯度酒精干燥，二甲苯處理并中性樹脂封固，作為陰性﹑陽性對照[6]。

免疫組織化學法結(jié)果判斷標準：CAⅨ蛋白的陽性著色主要定位于細胞漿﹑細胞膜，呈黃色﹑棕黃色﹑褐色表達，在400倍顯微鏡下選取5個視野，進行觀察。根據(jù)著色強度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色﹑黑色；根據(jù)陽性細胞比例：陽性細胞數(shù)目所占比例＜10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩種積分相乘，總分＜3分為陰性﹑≥3分為陽性。總分＜3分為陰性（-），3～5分為弱陽性（+），6～9分為陽性（++），＞9分為強陽性（+++）。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SAS 9.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種組織標本中CAⅨ蛋白的表達

乳腺癌組織的CAⅨ蛋白陽性表達率為61.67%，乳腺良性腫瘤為18.75%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=35.796，P=0.000），乳腺癌組織的CAⅨ蛋白陽性表達率高于乳腺良性腫瘤。見表1和附圖。

2.2 乳腺癌組織中CAⅨ蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

乳腺癌組織CAⅨ蛋白陽性表達與患者TNM分期﹑分化程度﹑Ki-67蛋白表達有相關(guān)性（P＜0.05），與患者年齡﹑淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移﹑病灶直徑﹑ER﹑PR﹑Cerb-2蛋白表達無相關(guān)性（P＞0.05）。見表2。

表1 兩種組織標本中CAⅨ蛋白的表達比較

附圖 乳腺癌組織和乳腺良性腫瘤中CAⅨ蛋白的表達 （免疫組織化學法×200）

表2 不同臨床病理特征與乳腺癌組織CAⅨ蛋白表達的關(guān)系

3 討論

乳腺癌是一種嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)展到今天，在傳統(tǒng)外科治療和放化療的基礎(chǔ)上，相繼出現(xiàn)了生物靶向治療﹑內(nèi)分泌治療等新的治療方法，分子生物學領(lǐng)域的研究已成為當今乳腺癌研究的重點和熱點，也取得了一定的成績。異常增殖的腫瘤往往處于低氧和酸性的微環(huán)境中[7]，因為腫瘤細胞的爆發(fā)性復(fù)制會導(dǎo)致局部氧濃度不足，而腫瘤本身的供氧無法滿足大量氧需求，這就造成腫瘤細胞更多地靠無氧呼吸來提供能量，產(chǎn)生較多的酸性物質(zhì)，導(dǎo)致細胞外pH值下降，所以低氧和酸化是腫瘤微環(huán)境的2個重要特征[8-9]。這種特殊的微環(huán)境會改變腫瘤基因的表達和相關(guān)蛋白質(zhì)的合成，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]，影響腫瘤患者預(yù)后。

CAⅨ是最早在人宮頸癌海拉細胞系中發(fā)現(xiàn)的碳酸酐酶家族的重要異構(gòu)體，成熟的CAⅨ主要分布于細胞膜，具有N端獨特的蛋白多糖領(lǐng)域﹑細胞外區(qū)﹑跨膜區(qū)和細胞內(nèi)C末端4個特征性部分，是一種與腫瘤具有高度相關(guān)性的跨膜蛋白[11]。CAⅨ蛋白具有將細胞內(nèi)的氫離子轉(zhuǎn)移到細胞外的作用，維持腫瘤細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定，使腫瘤的微環(huán)境保持在一個相對酸性的狀態(tài)，在一定程度上影響腫瘤基因的表達和蛋白質(zhì)的合成，使腫瘤侵襲性增加，減少腫瘤細胞的凋亡[12]。在本研究中，乳腺癌組織CAⅨ蛋白陽性表達率為61.67%，高于乳腺良性腫瘤的18.75%，而且乳腺癌組織中CAⅨ蛋白陽性表達與患者的TNM分期﹑分化程度有相關(guān)性，CAⅨ蛋白能增加腫瘤侵襲性，從而影響諸如腫瘤形態(tài)﹑淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移的情況，說明CAⅨ蛋白有作為一種獨立的影響乳腺癌預(yù)后因素的潛力，可用于臨床乳腺癌的診斷和治療。

Ki-67蛋白是一種定位于細胞核的蛋白，表達水平與處于有絲分裂的細胞數(shù)量有關(guān)，是細胞增殖的指標之一，在M期高表達，G0期不表達，細胞分裂像后期和末期迅速下降[13]，對Ki-67進行免疫組織化學法測定已被廣泛應(yīng)用于判定乳腺癌細胞增殖性強弱﹑判斷化療和內(nèi)分泌治療效果的指標[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織CAⅨ蛋白陽性表達與患者Ki-67蛋白表達相關(guān)，說明CAⅨ蛋白表達極可能與乳腺癌細胞的增殖性有一定聯(lián)系。有學者使用CAⅨ單克隆抗體和特異性CAⅨ小分子抑制劑減低CAⅨ活性，從而改變腫瘤微環(huán)境，在一定程度上控制原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[15]。這在一定程度上說明CAⅨ蛋白有作為乳腺癌藥物治療靶點的潛力。

綜上所述，CAⅨ蛋白在乳腺癌組織中高表達，并且與患者TNM分期﹑分化程度﹑Ki-67蛋白表達相關(guān)，未來可能作為一個評價乳腺癌惡性程度﹑評估乳腺癌轉(zhuǎn)移情況的臨床指標，并作為藥物治療靶點，在乳腺癌的治療中發(fā)揮重要作用。

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