甄艷鳳 ，劉興宇 ，房輝 ，田駱冰 ，徐剛 ，楊岳 ，孫雪玲，張鶴，許靜，周蕾

（河北省唐山市工人醫(yī)院 1.內(nèi)分泌二科，2.神經(jīng)外科，3.燒傷科，河北 唐山 063000）

肥胖相關(guān)基因（fat mass and obesity associated,FTO）rs9930506位點(diǎn)是目前研究最多的位點(diǎn)之一，國(guó)外研究顯示，F(xiàn)TO與體重增加和2型糖尿?。╰yp2 diabetes mellitus, T2DM）的易感性有關(guān)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)FTO-rs9930506多態(tài)性與認(rèn)知相關(guān)[3]。T2DM患者存在認(rèn)知損傷，尤以學(xué)習(xí)﹑記憶損傷為主，但其具體機(jī)制仍不清楚[4-5]。因此，本研究旨在探討FTO-rs9930506位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM發(fā)病及認(rèn)知功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年3月-2010年3月于河北省唐山市工人醫(yī)院住院的T2DM患者450例作為T2DM組。其中，男性232例，女性218例；平均年齡（55.0±13.4）歲；平均受教育（9.8±1.6）年。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合世界衛(wèi)生組織1999年T2DM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有腦出血﹑腦血栓等腦血管病史；②存在影響認(rèn)知的嚴(yán)重視力﹑聽力及肢體障礙者；③存在影響認(rèn)知的如顱腦外傷﹑腫瘤及癡呆等中樞性神經(jīng)損傷病史；④藥物濫用或酒精依賴者；⑤非漢族者；⑥不愿參加本研究者。選取同期于北京某社區(qū)招募的志愿者512例無T2DM者作為對(duì)照組。其中，男性264例，女性248例；平均年齡（55.5±12.6）歲；平均受教育（11.4±2.6）年。兩組患者年齡﹑受教育年限及性別比例相匹配。所有患者簽署研究知情同意書，并獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 資料收集

收集所有患者的性別﹑年齡﹑受教育程度﹑身高﹑體重﹑收縮壓及舒張壓等一般資料。

1.3 血清指標(biāo)檢測(cè)及基因組DNA提取

采取所有受試者3 ml外周靜脈血，2 000 r/min低溫離心10min，分別收集血清及血細(xì)胞。血清空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）﹑總膽固醇（total cholesterol, TC）﹑空腹胰島素（Fasting serum lisulin,FINS）及三酰甘油（Triglyceride, TG）的檢測(cè)分別使用酶比法﹑甘油磷酸氧化酶法﹑電化學(xué)發(fā)光法及氧化酶法。穩(wěn)態(tài)胰島素評(píng)價(jià)指數(shù)（homeostasis model assessment-insulin resistance，HOMA-IR）=（空腹胰島素×空腹血糖）/22.5；使用博邁德中量血DNA提取試劑盒提取血細(xì)胞基因組DNA。

1.4 患者認(rèn)知功能評(píng)價(jià)

所有患者的認(rèn)知功能使用神經(jīng)心理狀態(tài)評(píng)定量表（repeatable battery for the assessment of neuropsychological status, RBANS）進(jìn)行評(píng)價(jià)[7]。此量表包括5個(gè)分量表，分別為注意﹑視覺廣度﹑言語功能﹑即刻及延遲記憶。張保華等[8]于2008年將本量表引進(jìn)中國(guó)，并進(jìn)行該量表在中國(guó)人群的信度和效度分析，發(fā)現(xiàn)重測(cè)信度為0.90，Cronbach α系數(shù)為0.90，在中國(guó)人群具有良好的信度和效度。3位研究者于量表評(píng)估前進(jìn)行一致性培訓(xùn)，培訓(xùn)結(jié)束后其RBANS總分組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（interclass correlation coefficient，ICC）＜0.8。

1.5 FTO-rs9930506基因多態(tài)性檢測(cè)

使用Primer 5引物設(shè)計(jì)軟件，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物。rs9930506正向引物：5’-AACAAAGGT GGGCATAGAGAT-3’，反向引物：5’-ACTGGGCCTG CTGTCATT-3’。PCR反應(yīng)：總體系25.0μl，包括4.0μl引物（10 pmol/μl），3.0μl 45 ng模板 DNA，1.0μl高質(zhì)量的脫氧核糖核苷酸（2 mmol/L），1.5μl MgCl2（25 mmol/μl），Taq DNA 聚合酶 1μl，2.5μl 10×PCR buffer，高血去離子水補(bǔ)齊至25.0μl。試劑均購(gòu)于大連寶生生物工程有限公司。

PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)定：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30 s，54.6℃退火30 s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)，72℃繼續(xù)延伸10min。TaiⅠ酶購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司。TaiⅠ酶酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳（2.8%），結(jié)果行UVP凝膠成像系統(tǒng)查看，行基因型分型。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析；計(jì)數(shù)資料以率表示，比較用χ2檢驗(yàn)，樣本群體代表性采用Hardy-Weinberg檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FTO-rs9930506位點(diǎn)基因分型結(jié)果

經(jīng)TaiⅠ限制性內(nèi)切酶酶切后，PCR產(chǎn)物共分為3個(gè)基因型：野生型AA（360 bp）﹑雜合型AG（360﹑177和183 bp）及純和型GG（177和183 bp）。見圖1。

圖1 FTO-rs9930506位點(diǎn)酶切產(chǎn)物電泳圖

2.2 兩組患者FTO-rs9930506位點(diǎn)等位基因及基因型頻率比較

T2DM組與對(duì)照組基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。兩組患者rs9930506位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組女性患者rs9930506位點(diǎn)等位基因頻率比較，采用χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且女性等位基因G攜帶者T2DM的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)是等位基因A攜帶者的1.464倍，F(xiàn)TO-rs9930506在女性T2DM組與對(duì)照組的基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組男性受試者rs9930506位點(diǎn)基因型及等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 T2DM組FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者臨床指標(biāo)比較

T2DM組FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者體重指數(shù)（body mass index, BMI）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），GG基因型攜帶者高于AA﹑AG基因型攜帶者。見表2。

2.4 T2DM組FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者RBANS評(píng)分比較

T2DM組FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者言語能力﹑延遲記憶評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 3。

表1 各等位基因及基因型頻率比較 例（%）

表2 T2DM組患者FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者臨床指標(biāo)比較 （±s）

表2 T2DM組患者FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者臨床指標(biāo)比較 （±s）

AA 9.6±4.1 2.0±1.4 1.2±0.4 5.2±1.3 4.5±3.4 2.8±0.8 25.2±3.4 AG 9.3±2.9 2.0±2.0 1.2±0.3 5.0±1.2 3.7±2.5 2.8±0.9 26.1±3.1 GG 9.3±3.0 2.2±1.7 1.1±0.4 5.2±2.4 5.5±2.7 3.0±0.9 28.5±2.0 F值 0.154 0.050 0.433 0.534 1.960 0.283 4.112

表3 T2DM組FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者RBANS評(píng)分比較 （分，±s）

表3 T2DM組FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者RBANS評(píng)分比較 （分，±s）

AA 88.1±16.7 88.4±13.1 97.6±14.9 74.9±15.5 87.4±13.0 83.6±16.1 AG 81.7±14.4 82.7±19.1 83.8±13.9 68.7±15.7 76.0±12.5 73.0±14.6 GG 82.1±13.0 81.4±15.7 83.9±14.5 67.1±14.9 75.8±11.5 71.9±13.0 F值 0.725 0.660 3.070 1.044 3.264 2.473

3 討論

肥胖是T2DM發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素，而影響肥胖的遺傳變異可能也會(huì)影響T2DM的發(fā)病。FTO主要位于下丘腦核群，該核群主要作用為管理能量平衡，該基因與肥胖相關(guān)，所以稱它為肥胖基因。有研究發(fā)現(xiàn)FTO基因與肥胖相關(guān)的SNPs均位于第1個(gè)內(nèi)含子內(nèi)，該內(nèi)含子在遺傳上具有高度的保守性，而位于第1個(gè)內(nèi)含子的rs9930506位點(diǎn)是目前研究最多的位點(diǎn)之一[1]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在總體樣本中，兩組患者FTO-rs9930506基因型及等位基因頻率比較均無差異，這與LI等的研究結(jié)果一致[9]。目前在亞洲人群中對(duì)于FTO基因多態(tài)性與T2DM發(fā)病的相關(guān)研究較多，但研究結(jié)果不僅在亞洲人群中不盡一致，與歐洲人群研究結(jié)果也有差別，提示：FTO基因不同位點(diǎn)的多態(tài)性具有地區(qū)﹑種族差異[9-14]。本研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)漢族女性G等位基因攜帶者發(fā)生T2DM的風(fēng)險(xiǎn)是A等位基因攜帶者的1.464倍，提示中國(guó)漢族女性T2DM發(fā)病的危險(xiǎn)等位基因是G等位基因，與LI等[9]的研究結(jié)果不同的是，筆者只在中國(guó)漢族女性人群中發(fā)現(xiàn)了該位點(diǎn)多態(tài)性與T2DM的發(fā)病相關(guān)，而LI等未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。國(guó)外研究在歐洲白種人群中發(fā)現(xiàn)了FTO-rs9930506基因多態(tài)性與T2DM總體樣本發(fā)病的相關(guān)性[1]。本研究樣本量少，且限于河北地區(qū)，筆者會(huì)在以后的研究中加大樣本量，希望能得到更好的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)T2DM組FTO-rs9930506位點(diǎn)各基因型攜帶者延遲記憶﹑言語能力有差異（P＜0.05），且在校正BMI的影響后，延遲記憶比較有差異（P＜0.05），提示GG基因型為T2DM認(rèn)知損傷的危險(xiǎn)基因型，本研究還發(fā)現(xiàn)GG基因型攜帶者BMI高于AA﹑AG基因型攜帶者，這可能與肥胖導(dǎo)致胰島素抵抗（insulin resistance，IR），IR參與認(rèn)知損傷相關(guān)[15-16]。有研究證實(shí)，F(xiàn)TO mRNA在大腦表達(dá)，尤以下丘腦區(qū)域表達(dá)最多，攝食調(diào)控FTO mRNA在大腦弓狀核的表達(dá)[17]。FTO還可影響大腦皮層對(duì)胰島素的敏感性，F(xiàn)TO基因多態(tài)性可致大腦對(duì)胰島素的敏感性下降[18]。胰島素可影響認(rèn)知，大腦對(duì)胰島素的敏感性降低，最終會(huì)影響認(rèn)知功能。肥胖患者于外周則表現(xiàn)為高胰島素血癥，從而使外周向大腦運(yùn)輸?shù)囊葝u素量減少，大腦胰島素總量降低，神經(jīng)元β-淀粉樣蛋白（beta amyloid protein，Aβ）產(chǎn)生增多，而胰島素降解酶的活性降低，又使Aβ寡聚化以致堆積，Aβ具有神經(jīng)毒性，使神經(jīng)元損害，最終導(dǎo)致認(rèn)知損傷[19]。作用于N-甲基-D-天門冬氨酸受體的胰島素可使長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)，改善認(rèn)知功能，但當(dāng)IR時(shí)，胰島素敏感性降低，致認(rèn)知損傷[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)FTO基因多態(tài)性與阿爾茨海默癥認(rèn)知損傷相關(guān)[1]。

綜上所述，F(xiàn)TO基因rs9930506位點(diǎn)G等位基因是中國(guó)女性T2DM發(fā)病的危險(xiǎn)等位基因，F(xiàn)TO-rs9930506基因多態(tài)性參與T2DM認(rèn)知損傷。

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