劉義鋒，張保朝，溫昌明，聞公靈，周國平，張敬偉，賀海發(fā)，汪寧，李巍

（1.鄭州大學(xué)附屬南陽中心醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，河南 南陽 473003；2.鄭州大學(xué)附屬南陽中心醫(yī)院 神經(jīng)外科，河南 南陽 473003；3.鄭州大學(xué)附屬南陽中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，河南南陽 473003；4.鄭州大學(xué)附屬南陽中心醫(yī)院 病理科，河南 南陽 473003；5.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽 110016）

腦膜瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤之一，其發(fā)病率占顱內(nèi)腫瘤的13%～26%，僅次于神經(jīng)膠質(zhì)瘤[1]。部分早期文獻(xiàn)報道，放射治療對腦膜瘤的敏感性較低[2]。但是放射治療已成為一種重要的治療腦膜瘤的方法。

目前，microRNA（miRNA）在腦膜瘤中的研究較少，可能與其為良性腫瘤有關(guān)。有研究報道，miR-200a可以通過調(diào)控E-cadherin和Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)腦膜瘤腫瘤細(xì)胞的生長[3]。本文主要研究miR-153在腦膜瘤細(xì)胞放療敏感性中的作用及其機(jī)制，為研究腦膜瘤的放射治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人類惡性腦膜瘤細(xì)胞系SF3061為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株，DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），miR-153mimics﹑miR-control購自廣州銳博生物科技有限公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（美國Promega公司），視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白結(jié)合鋅指1（retinoblastoma protein-interacting zinc finger 1, RIZ1）抗體﹑β-actin抗體及酶標(biāo)二抗購自美國Cell Signaling Technology公司，si-RIZ1及sicontrol﹑Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒﹑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒﹑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自美國Introvigen公司，醫(yī)用直線加速器（德國Siemens公司），流式細(xì)胞儀（美國BD公司），其他常用試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將液氮中凍存的SF3061細(xì)胞復(fù)蘇，在5%二氧化碳CO2﹑37℃及飽和濕度條件下的DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清﹑2μmol/L L-谷氨酰胺﹑50 IU/ml青霉素）中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板，所用培養(yǎng)液不含抗生素，在5% CO2﹑37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別將miR-153mimics﹑miR-control﹑si-RIZ1及si-control轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞輻射 在細(xì)胞轉(zhuǎn)染或藥物處理48后，使用直線加速器6 MeV-X射線垂直照射細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)過程中使用射線防護(hù)鉛屏風(fēng)保護(hù)工作人員避免輻射損傷，輻射劑量分別為0﹑2﹑4﹑6和8 Gy，檢測凋亡的細(xì)胞輻射量為4 Gy，照射后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR） 將照射處理后的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)融合率達(dá)70%～80%時，收集細(xì)胞，用miRNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中的miRNA。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將miRNA轉(zhuǎn)化成cDNA，加入SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，以U6為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，miRNA的相對表達(dá)量用2-△△Ct分析。

1.2.5 Western blot檢測 將照射處理后的細(xì)胞消化并離心收集，加入RIPA使細(xì)胞裂解，超聲破碎后離心收集蛋白，用BCA試劑盒測定總蛋白濃度。每個樣本取50μg進(jìn)行8%或12% SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h后，加入RIZ1一抗，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h。ECL顯影檢測蛋白表達(dá)。

1.2.6 MTT法 將照射處理后的細(xì)胞進(jìn)行消化，以2×105個/孔的密度接種于96孔板中，37℃﹑5%CO2﹑完全濕度條件下培養(yǎng)48 h，加入10μl MTT溶液，孵育4 h后，棄掉培養(yǎng)液，加入150μl/孔MTT溶液，震蕩搖勻后，酶標(biāo)儀檢測490 nm處的光密度（optical density, OD）值，細(xì)胞的增殖抑制率=（對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/對照組OD值×100%。

1.2.7 流式細(xì)胞儀 將待測細(xì)胞使用4 Gy的放射線劑量進(jìn)行照射，照射后48 h收集細(xì)胞，放射處理后將細(xì)胞消化計數(shù)并接種到6孔板中，PBS清洗3次，使用500μl Binding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/孔，各孔加入5 μl Annexin V-FITC和5μl PI混勻，室溫避光孵育15min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 克隆形成實(shí)驗(yàn) 分別以0﹑2﹑4﹑6﹑8和10 Gy劑量照射細(xì)胞后，將各組單細(xì)胞懸液接種到6孔板中，于37℃﹑5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d。PBS清洗3次，甲醇固定后，用吉姆薩染色，于顯微鏡下進(jìn)行集落計數(shù)（＜50個細(xì)胞的集落為有效集落），計算克隆形成率，并根據(jù)單擊多靶模型擬合細(xì)胞存活曲線。

1.2.9 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn) 將含有miR-153結(jié)合位點(diǎn)的PRDM2 3’-UTR序列及其突變體插入pMIRREPORT載體熒光素酶報告基因下游，分別得到含野生型RIZ1 3’-UTR的載體，命名為WT-3’-UTR；含突變型RIZ1 3’-UTR的載體，命名為MUT-3’-UTR。將構(gòu)建好的質(zhì)粒分別與miR-153 mimics﹑miR-control共轉(zhuǎn)染SF3061細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放療對腦膜瘤細(xì)胞內(nèi)miR-153表達(dá)的影響

本實(shí)驗(yàn)以4 Gy的放射量對腦膜瘤細(xì)胞進(jìn)行放療，利用qRT-PCR檢測放療前后細(xì)胞內(nèi)miR-153表達(dá)水平的變化。mRNA定量檢測結(jié)果表明，與對照組相比，放療組miR-153相對表達(dá)水平為（0.45±0.05），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.590，P=0.007），放療組miR-153的表達(dá)水平低于對照組。見圖1。

2.2 高表達(dá)miR-153對腦膜瘤細(xì)胞放療敏感性的影響

本實(shí)驗(yàn)將miR-153mimics及其對照miR-control轉(zhuǎn)染到腦膜瘤細(xì)胞中，觀察高表達(dá)miR-153在腦膜瘤細(xì)胞放療敏感性中的作用。對照組﹑miR-control組﹑miR-153mimics組在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射劑量下細(xì)胞的增殖抑制率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=35.325﹑91.020﹑85.868﹑136.220和73.608，P=0.001﹑0.000﹑0.000﹑0.000和 0.000），放療后高表達(dá)miR-153可以增加腦膜瘤細(xì)胞的增殖抑制率。見表1和圖2。

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，放療后對照組﹑miR-control組﹑miR-153mimics組腦膜瘤細(xì)胞的凋亡率 分 別 為（16.79±2.16）%﹑（19.85±2.36）% 和（35.75±4.45）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.956，P=0.0.006），高表達(dá)miR-153腦膜瘤細(xì)胞的凋亡率高于對照組和miR-control組。見表1和圖3。

圖1 放療前后腦膜瘤細(xì)胞中miR-153的表達(dá)水平比較（±s）

表1 高表達(dá)miR-153克隆形成實(shí)驗(yàn)單擊多靶模型的參數(shù)

圖2 高表達(dá)miR-153對腦膜瘤細(xì)胞增殖的影響

對照組與miR-153mimics組在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射劑量下的細(xì)胞克隆形成率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.004﹑12.713﹑ 12.068﹑14.751和10.063，均P=0.000），高表達(dá)miR-153細(xì)胞放療后克隆形成率較對照組降低。對克隆形成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-153細(xì)胞具有較高的放療增敏性。見表1和圖4。

2.3 miR-153靶向RIZ1

本實(shí)驗(yàn)利用TargetScan預(yù)測miR-153的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIZ1的基因PRDM2 3’-UTR與miR-153可能有相互作用。見圖5。

Western blot檢測結(jié)果表明，miR-control組﹑miR-153mimics組RIZ1蛋白相對表達(dá)量分別為（2.71± 0.23）和（0.41±0.03），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.175，P=0.000），在高表達(dá)miR-153細(xì)胞中，RIZ1的表達(dá)降低。見圖6。

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-153mimics的RIZ1野生型﹑RIZ1突變型細(xì)胞相對熒光素酶活性分別為（0.43±0.05）和（1.12±0.09），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.608，P=0.000），共轉(zhuǎn)染RIZ1野生型細(xì)胞的熒光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染RIZ1突變型細(xì)胞，證實(shí)RIZ1為miR-153的靶標(biāo)，其在腦膜瘤放療敏感性中發(fā)揮重要作用。見圖7。

2.4 基因敲除RIZ1對腦膜瘤細(xì)胞放療敏感性的影響

通過TargetScan預(yù)測及雙熒光素酶報告基因證實(shí)miR-153能夠直接靶向RIZ1。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索miR-153是否通過靶向RIZ1而增加腦膜瘤細(xì)胞的放療敏感性。首先利用基因敲除技術(shù)將RIZ1基因沉默，再檢測RIZ1沉默后細(xì)胞的增殖﹑凋亡及克隆形成情況。對照組﹑si-control組﹑si-RIZ1組在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射劑量下細(xì)胞的增殖抑制率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=156.500﹑60.875 ﹑78.868 ﹑ 82.581和 52.625，均P=0.000），表明 RIZ1沉默后細(xì)胞的放療敏感性增加，細(xì)胞的生長抑制率升高。見表2和圖8。

si-control組與si-RIZ1組在2﹑4﹑6﹑8和10 Gy放射劑量下的細(xì)胞克隆形成率比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.455﹑9.959﹑11.356﹑11.590和9.093，均P=0.000），表明RIZ1沉默后細(xì)胞的克隆形成數(shù)減少。見表2和圖9。

凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組﹑si-control組﹑si-RIZ1組腦膜瘤細(xì)胞的凋亡率分別為（15.6±1.68）%﹑（17.6±2.13）%和（36.8±4.12）%，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.363，P=0.007），si-RIZ1組腦膜瘤細(xì)胞的凋亡率高于對照組和si-control組。對細(xì)胞克隆形成數(shù)據(jù)進(jìn)行存活曲線擬合，結(jié)果顯示RIZ1沉默后放療敏感性增加，表明miR-153可以通過靶向RIZ1，增加腦膜瘤細(xì)胞放射敏感性。見表2和圖10。

圖4 細(xì)胞的克隆形成率

圖5 miR-153與RIZ1的結(jié)合位點(diǎn)

圖6 轉(zhuǎn)染miR-153后RIZ1蛋白的表達(dá)

圖7 雙熒光素酶活性比較 （±s）

表2 基因敲除RIZ1克隆形成實(shí)驗(yàn)單擊多靶模型的參數(shù)

圖8 敲除RIZ1對腦膜瘤細(xì)胞增殖的影響

圖9 兩組細(xì)胞克隆形成率比較

圖10 基因敲除RIZ1對腦膜瘤細(xì)胞凋亡的影響 （±s）

3 討論

腦膜瘤是常見的顱內(nèi)腫瘤之一，其首選的治療方法是手術(shù)切除，術(shù)后的輔助治療取決于腫瘤的切除程度和腦膜瘤的病例類型。腦膜瘤的術(shù)后輔助放療可以用于良性腦膜瘤次全切除術(shù)后﹑惡性腦膜瘤的術(shù)后放療及不典型增生型腦膜瘤切除術(shù)后[4]。另外，部分患者有手術(shù)禁忌證，手術(shù)實(shí)施困難或存在術(shù)后高風(fēng)險，可以首選放療。因此，了解腦膜瘤的放療機(jī)制有助于其在腦膜瘤臨床中的應(yīng)用。

miRNA廣泛存在于真核生物中，是一類由19～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，可以通過與靶基因相互作用而降解靶mRNA或抑制靶基因的翻譯，還可以調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯而對靶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[5]。miRNA與腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展及抗腫瘤的放化療敏感性密切相關(guān)。陳華林等[6]報道，miR-125a高表達(dá)后可以增加肺癌A549細(xì)胞的放療敏感性，增加放療后細(xì)胞的凋亡率。將miR-18a模擬物轉(zhuǎn)染到A549肺癌細(xì)胞中，檢測不同劑量照射后細(xì)胞的克隆形成能力及存活能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)miR-18a可以增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞的放療敏感性，miR-18a可能是通過下調(diào)共濟(jì)失調(diào)-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突變基因的表達(dá)，介導(dǎo)細(xì)胞的放療敏感性[7]。

在本研究中，經(jīng)過4 Gy劑量的放療，細(xì)胞中miR-153的表達(dá)降低，筆者推測miR-153可能與腦膜瘤的放療敏感性相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-153模擬物轉(zhuǎn)入腦膜瘤細(xì)胞中，觀察高表達(dá)miRNA-153對腦膜瘤細(xì)胞放療敏感性的影響，結(jié)果表明經(jīng)過放療，高表達(dá)miR-153可以提高腦膜瘤細(xì)胞的增殖抑制率和凋亡率，抑制細(xì)胞的克隆形成率，證實(shí)miR-153可以在腦膜瘤中增加放療敏感性。miR-153的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展相關(guān)，如前列腺癌中，高表達(dá)miR-153可以促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而抑制miR-153的表達(dá)起到相反的作用[8]。在上皮癌中，下調(diào)miR-153可以促進(jìn)細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移[9]。miR-153在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，其可以通過靶向整合素和金屬蛋白酶19，抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移[10]。KIM等[11]在少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤中篩選了與放療敏感性相關(guān)的miRNA，共65個，miR-153在少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后放療中表達(dá)上調(diào)。大量文獻(xiàn)證明，miR-153與腫瘤細(xì)胞放療敏感性關(guān)系密切。

RIZ是新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，是用Rb探針對可與Rb結(jié)合的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性篩選時分離出來的[12]。該基因在人類染色體的位置為1p36。RIZ1基因基于轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的不同可表達(dá)2種蛋白：RIZ1和RIZ2。RIZ1蛋白屬于殼蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶超家族，該家族成員在人體生長發(fā)育及腫瘤形成過程中發(fā)著重要作用[13]。RIZ1可以通過其PR-domain，介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及鋅指結(jié)構(gòu)來調(diào)控染色質(zhì)的表達(dá)[14]。

隨著對RIZ研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其與多種腫瘤的發(fā)生﹑發(fā)展密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，80%肝癌細(xì)胞中未檢測到RIZ1的轉(zhuǎn)錄，而在肝癌組織中RIZ1也呈低表達(dá)，高表達(dá)的RIZ1在肝癌細(xì)胞系中可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。在乳腺癌的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，RIZ1在乳腺癌組織或細(xì)胞系中表達(dá)降低，高表達(dá)RIZ1可以阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。在卵巢癌中，卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中RIZ1基因和蛋白表達(dá)均低于正常的卵巢組織[17]。RIZ1的表達(dá)還能夠誘導(dǎo)AML193和K562髓性白血病細(xì)胞株的凋亡[18]。在腦膜瘤中，高表達(dá)的RIZ1可以抑制細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[19]。本研究首先通過TargetScan預(yù)測RIZ1可能是miR-153的靶基因，RIZ1的基因PRDM2 3’-UTR可能與miR-153有相互作用，進(jìn)一步的雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)RIZ1為miR-153的靶標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)又用基因敲除技術(shù)將RIZ1基因沉默，發(fā)現(xiàn)RIZ1沉默后能夠增加腦膜瘤細(xì)胞的放療敏感性，結(jié)果提示RIZ1可能與腫瘤細(xì)胞的放療敏感性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)證明，miR-153通過靶向干擾RIZ1，增加腦膜瘤細(xì)胞的放療敏感性。這對防止腦膜瘤術(shù)后復(fù)發(fā)及增加腦膜瘤的放療效果具有重要意義，也為治療腦膜瘤提供了新的靶標(biāo)。

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