徐玉婷 余照娟 李緒清 章志國 魏兆蓮

在常規(guī)體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)的過程中，受精失敗時有發(fā)生，導(dǎo)致患者無胚胎可移植，被迫放棄本周期，給其帶來巨大的精神負擔(dān)和經(jīng)濟損失。目前研究[1-3]認為，采用短時受精聯(lián)合早期補救卵泡漿內(nèi)單精子注射(rescue intracytoplasmic sperm injection，rescue ICSI)的方法可提高受精率，降低周期取消率，改善臨床妊娠結(jié)局。然而，與常規(guī)ICSI相比，早期補救ICSI的操作時間滯后約6 h，卵子在體外孵育時間延長，對后續(xù)胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響報道不一[4-5]。目前，關(guān)于早期補救ICSI與下一周期直接ICSI的對比研究也缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。本文通過回顧性分析短時受精聯(lián)合早期補救ICSI與相同不孕因素第1周期IVF/補救ICSI失敗、第2周期行直接ICSI的臨床資料，以同期因男方因素行ICSI的患者作為對照，以探討早期補救ICSI的臨床應(yīng)用價值。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年1月至2017年1月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心行助孕治療的患者，選擇其中首次IVF卵子完全不受精，行早期補救ICSI的患者，共197例，為觀察組A組(A組)；因第1周期行IVF或補救ICSI未妊娠、第2周期行直接ICSI的患者，共201例，為觀察組B組(B組)。觀察組均滿足非男性不孕因素，即精液常規(guī)參數(shù)達WHO精液正常標(biāo)準(zhǔn)[6]。以同期因單純男性不育因素行直接ICSI的患者，共408例，為對照組C組(C組)，C組直接ICSI的指征為[7]：精液常規(guī)分析為嚴重少精、弱精、畸形精子癥，梗阻性無精子癥(穿刺后有成熟精子)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①女方年齡22～42歲，卵巢功能正常；②不孕年限≤15 年；③女方體質(zhì)指數(shù)(body mass index，BMI)為18～25 kg/m2；④獲卵總數(shù)≥5個，并排除獲卵數(shù)過少對受精結(jié)局的影響。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①夫婦雙方任意一方染色體異常；②女方生殖道畸形、子宮內(nèi)膜損傷；③不良妊娠史、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、不明原因不孕。

A、B 、C 3組患者在女方年齡、男方年齡、不孕年限、女方體質(zhì)指數(shù)、促性腺激素(gonadotropin，Gn)用量、基礎(chǔ)性激素水平[卵泡刺激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)和雌二醇(estrogen，E2)]、獲卵數(shù)及成熟卵細胞數(shù)方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)，資料具有可比性。詳見表1。

表1 3組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案 依據(jù)患者年齡、BMI、基礎(chǔ)性激素水平及促排卵過程中卵巢反應(yīng)等情況，按照本中心常規(guī)，進行控制性促排卵方案。

1.2.1.1 長方案 患者自黃體中期，給予促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasing hormone-agonists，GnRH-a)，單次肌肉注射達菲林(3.75毫克/支，法國益普生生物技術(shù)公司)0.8～1.3 mg，或皮下注射達必佳(0.1毫克/支，瑞士輝凌國際制藥有限公司)0.05 mg/d至人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)注射日；降調(diào)節(jié)14天后，達垂體降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)[8]：①子宮內(nèi)膜厚度≤5 mm；②雙側(cè)卵巢竇卵泡直徑≤10 mm；③FSH<5 U/L，LH<5 U/L，E2<183 pmol/L。肌肉注射Gn(可供選擇的有果納芬每支75 U，德國默克雪蘭諾公司；賀美奇每支75 U，瑞士輝凌國際制藥有限公司；麗申寶每支75 U，珠海市麗珠制藥廠；普麗康每支100 U，美國默沙東制藥有限公司)150～225 U/d促排卵，依據(jù)陰道超聲監(jiān)測的竇卵泡直徑、血清性激素水平調(diào)整Gn用量，當(dāng)至少有2個優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時，停用Gn；當(dāng)晚肌肉注射hCG(每支5 000 U，珠海市麗珠制藥廠)10 000 U或艾澤(250 毫克/支，德國默克雪蘭諾公司)250 mg，36～38 h后，在超聲引導(dǎo)下行經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)，獲得的卵母細胞置于受精培養(yǎng)液(Fertilization液，美國Cook公司)中。

1.2.1.2 超長方案 患者在月經(jīng)周期第2日或第3日，肌肉注射達菲林3.75 mg，此后的第28日、第56日分別注射第2支、第3支，最后一支注射后的第 29～37天，檢查垂體達降調(diào)節(jié)后，應(yīng)用 Gn 150～225 U/d促排卵，其余同長方案。

1.2.1.3 短方案 患者于月經(jīng)周期第1～3日開始皮下注射達必佳0.1 mg/d至hCG注射日，月經(jīng)周期第3～5天加用Gn 150～225 U/d促排卵，其余同長方案。

1.2.1.4 拮抗劑方案 患者自月經(jīng)周期的第2～3日開始肌肉注射Gn 150～225 U/d促排卵，當(dāng)有1個優(yōu)勢卵泡直徑≥14 mm或E2≥1 300 pmol/L時，開始皮下注射思則凱(0.25毫克/支，德國默克雪蘭諾公司)0.25 mg/d至hCG注射日，其余同長方案。

1.2.1.5 微刺激方案 患者于月經(jīng)周期第3日開始口服枸櫞酸氯米芬膠囊(50毫克/片，上海衡山藥業(yè)有限公司)100 mg/d，第5日加用尿促性腺素(每支75 U，煙臺北方制藥有限公司)150～225 U/d促排卵，至hCG注射日，其余同長方案。

1.2.2 精液準(zhǔn)備 男方禁欲3～5 d后，在取卵日以手淫方式或手術(shù)穿刺取精，參照WHO標(biāo)準(zhǔn)[6]對精液進行常規(guī)分析和形態(tài)檢測，采用密度梯度離心法或上游法處理精液。

1.2.3 受精情況 卵母細胞體外培養(yǎng)3 h后，B組和C組行ICSI顯微注射，操作液為PVP(美國Sage公司)，A組加入精子密度為(5～10)×105/mL的精液，采用短時受精，精卵共孵育4～6 h后，拆除卵母細胞外的顆粒細胞，觀察第二極體(the second polar body，2PB)的釋放，所有成熟卵母細胞均無2PB時，為完全受精失敗，即刻行補救ICSI。三組ICSI操作16～20 h后，觀察受精情況，雙原核(double protokaryon，2PN)雙極體形成者為正常受精，正常受精卵轉(zhuǎn)移至卵裂期培養(yǎng)液(cleavage液，美國Cook公司)中，置體積分數(shù)6%CO2、5%O2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 胚胎質(zhì)量評估 觀察第3日(D3)胚胎發(fā)育，依據(jù)卵裂后的細胞數(shù)、細胞形態(tài)及碎片情況，評估卵裂期胚胎質(zhì)量[9]。再將胚胎移入囊胚期培養(yǎng)液(blastocyst液，美國Cook公司)，繼續(xù)培養(yǎng)到第5天(D5)或第6天(D6)，觀察囊胚情況并分級，采用Gardner囊胚分級法[10]，D5：3AA、3AB、3BA、3BB；D6：4AA、4AB、4BA、4BB定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。

1.2.5 胚胎移植或冷凍 考慮到補救ICSI新鮮周期移植會使胚胎發(fā)育與內(nèi)膜生長不同步，故A組患者行全胚胎冷凍；B、C組依據(jù)患者的身體情況[11]并結(jié)合其意愿，行新鮮周期胚胎移植者，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎1～2枚，經(jīng)陰道移植入子宮，剩余胚胎冷凍，未移植患者行全胚胎冷凍。所有胚胎經(jīng)玻璃化冷凍保存于-196 ℃液氮中。

1.2.6 妊娠確認 冷凍胚胎者，根據(jù)排卵情況，選擇自然周期或激素替代周期，行內(nèi)膜準(zhǔn)備，胚胎復(fù)蘇后，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎的1～2枚，經(jīng)陰道移植入子宮。新鮮或冷凍胚胎移植后第14天檢測血中hCG濃度，若陰性，此次移植失??；陽性者為生化妊娠，于移植后第35天，行經(jīng)陰道超聲檢查，見宮內(nèi)孕囊診斷為臨床妊娠。

1.2.7 觀察指標(biāo) 統(tǒng)計3組患者的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及整個取卵周期的累計妊娠率。ICSI正常受精率=2PN數(shù)/成熟卵細胞數(shù)，卵裂率=2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)，優(yōu)質(zhì)胚胎率=來自2PN的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)；累計妊娠率=移植完一次取卵周期所有胚胎后妊娠的例數(shù)/移植完一次取卵周期所有胚胎的患者例數(shù)，其中同一患者納入統(tǒng)計的妊娠例數(shù)上限為1。

2 結(jié)果

2.1 3組患者助孕結(jié)果比較 A、B、C 3組患者正常受精率、卵裂率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；優(yōu)質(zhì)胚胎率、累計妊娠率觀察組兩組患者低于對照組(P<0.05)，觀察組A、B組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 3組患者助孕結(jié)果比較

注：*優(yōu)質(zhì)胚胎率A、B組比較：χ2=0.019，P=0.891；#周期累計妊娠率A、B組比較：χ2=0.001，P=0.981

3 討 論

受精是一個復(fù)雜的程序化過程，主要包括精子穿過透明帶、卵母細胞發(fā)生皮質(zhì)反應(yīng)、完成減數(shù)分裂、形成雌雄原核和啟動卵裂[12]，受精過程中任一環(huán)節(jié)異常，都會造成受精失敗。在常規(guī)IVF治療過程中，平均受精率已超過70%，但仍有5%～10%發(fā)生完全受精失敗[13]。男性方面：主要為精子功能低下、精子與卵子透明帶結(jié)合異常或穿透障礙[14]，即使精液常規(guī)分析為正常，其精子的受精能力仍受到質(zhì)疑，因為傳統(tǒng)的精液常規(guī)無法評估中心體功能或精子頂體反應(yīng)，因此不能準(zhǔn)確預(yù)測受精結(jié)果。女性方面：卵母細胞透明帶異常(包括透明帶過厚、結(jié)構(gòu)異常、表面缺乏精子受體)造成的精卵結(jié)合障礙[15]、卵母細胞成熟障礙或微觀結(jié)構(gòu)缺陷、顆粒細胞轉(zhuǎn)錄異常等。

Rawe等[16]研究發(fā)現(xiàn)，約55.5%的IVF受精失敗是由于精卵結(jié)合障礙導(dǎo)致的，可通過施行ICSI來改善[17]。ICSI 技術(shù)是通過顯微操作，將精子直接注射到卵母細胞胞質(zhì)內(nèi)，使精子避開透明帶和卵細胞膜的屏障而發(fā)生受精。受精的標(biāo)志是2PN形成和2PB釋放，成熟的卵母細胞停留在第二次減數(shù)分裂中期(MII期)，當(dāng)卵母細胞與精子結(jié)合受精，其被激活，完成減數(shù)分裂并釋放出2PB。2003年，Chen等[18]首次將補救ICSI的時間從原來的加精子后16～20 h提前至6 h，有效地改善了受精率、胚胎質(zhì)量和臨床妊娠結(jié)局。文獻[19-20]報道顯示，IVF受精卵在受精后4 h有78.3%的卵母細胞釋放2PB，6 h則達到92.9%。因此，可在IVF后6 h拆除卵母細胞外顆粒細胞觀察2PB釋放，及時發(fā)現(xiàn)受精失敗，及早進行補救ICSI。本研究中，盡管觀察組A組ICSI操作時間滯后B組6 h ，但在正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率及累計妊娠率上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這與戴蜜蜜等[21]的研究結(jié)果相似。上述結(jié)果表明把補救ICSI的操作時間控制在卵母細胞最佳受孕窗口10 h內(nèi)，對受精和受精卵的發(fā)育潛能沒有決定性的影響[22-24]。

本研究顯示，觀察組與對照組患者在正常受精率和卵裂率上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而觀察組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、累計妊娠率低于對照組，這提示在非男性不孕因素患者中，卵母細胞本身質(zhì)量缺陷是導(dǎo)致胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局欠佳的重要原因，ICSI操作盡管能夠減少精卵結(jié)合障礙導(dǎo)致的受精失敗，使異常卵母細胞受精并且卵裂，但不能挽救由卵母細胞質(zhì)量缺陷引起的胚胎發(fā)育異常。而A、B組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，進一步說明了卵母細胞在受精前已存在微觀結(jié)構(gòu)的缺陷。傳統(tǒng)的通過觀察卵母細胞形態(tài)評價卵母細胞質(zhì)量的方法存在很多缺陷，不能如實反映真實情況，因此，如何找到一個更準(zhǔn)確、更利操作的卵母細胞評價體系將是今后工作的重點。

臨床上，ICSI有著嚴格的適應(yīng)證，早期補救ICSI，在避免周期取消的同時也帶來遺傳風(fēng)險和子代安全性問題[25-26]。Huang等[27]發(fā)現(xiàn)，早期補救ICSI與常規(guī)IVF/ICSI分娩的新生兒相比，在性別、出生體重、出生缺陷上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Chen等[28]也認為補救ICSI與常規(guī)ICSI患者在新生兒性別、出生體重、出生缺陷、圍產(chǎn)期死亡率等方面相似。然而，早期補救ICSI的臨床應(yīng)用才剛起步，關(guān)于其子代的生長發(fā)育(身高體重、運動能力和智力水平等)，以及生殖功能等的評估，仍需長期的隨訪研究。

由于時間限制和失訪率增加，本研究未能統(tǒng)計妊娠后的流產(chǎn)、分娩、新生兒出生參數(shù)等情況。如何改進現(xiàn)有的精液分析方法、選擇較優(yōu)的卵母細胞評價體系、找到準(zhǔn)確預(yù)測受精失敗的手段，是生殖醫(yī)學(xué)工作者需要面對和亟待解決的問題。

綜上所述，短時受精聯(lián)合早期補救ICSI能夠挽救受精失敗，降低周期取消率，并與重復(fù)周期行ICSI有著相似的正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和累計妊娠率，值得臨床推廣。

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