林園園

[摘要]目的 研究虎杖苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠血管功能的影響。方法 選取高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠16只，制備動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型。將造模后的小鼠隨機(jī)分為模型組、實(shí)驗(yàn)組，每組8只；且隨機(jī)抽取8只SPF級(jí)C57/BL6小鼠為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組采用虎杖苷進(jìn)行16周的治療，模型組和對(duì)照組不做治療。采集治療前后各組小鼠的血清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、高密度脂蛋白（HDL-c）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）。治療周期結(jié)束后，制作小鼠動(dòng)脈血管組織切片，采用油紅O染色法，比較各組小鼠動(dòng)脈血管的斑塊面積比。結(jié)果 模型組和實(shí)驗(yàn)組治療前的TC、TG、LDL-c、TNF-α、IL-1β、IL-6、hs-CRP、T-AOC、MDA、MCP-1水平高于對(duì)照組，HDL-c、SOD、IL-10水平低于對(duì)照組（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組小鼠治療后的TC、TG、LDL-c、TNF-α、IL-1β、IL-6、hs-CRP、T-AOC、MDA、MCP-1水平低于模型組，HDL-c、SOD、IL-10水平高于模型組（P<0.05），且實(shí)驗(yàn)組動(dòng)脈血管斑塊面積顯著減少（P<0.05）。結(jié)論 虎杖苷對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠有一定的緩解和預(yù)防作用，能有效降低血脂，降低炎性細(xì)胞因子、趨化因子，增加血清免疫功能。

[關(guān)鍵詞]動(dòng)脈粥樣硬化；虎杖苷；血脂；趨化因子；血管功能

[中圖分類(lèi)號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）4（b）-0021-04

Influence of Polydatin on vascular function in the ApoE-/- mice with atherosclerosis

LIN Yuan-yuan

Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hubei Province，Wuhan 430074，China

[Abstract]Objective To study the influence of Polydatin on vascular function in the ApoE-/- mice with atherosclerosis.Methods To prepare the mouse model with therosclerosis，16 ApoE-/- mice with high fat diet were selected.The model mice were randomly divided into the model group and the experimental group，and 8 normal mice were chosen as the control group.The experimental group was treated with Polydatin for 16 weeks，while the model group and the control group was not treated.After and before the treatment，the serum was collected，and the triglyceride （TG），low density lipoprotein （LDL-c），tumor necrosis factor α （TNF-α），interleukin 1β （IL-1β），interleukin 6 （IL-6），high sensitive C-reactive protein （hs-CRP），total antioxidant capacity （T-AOC），malondialdehyde （MDA），monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1），high density lipoprotein （HDL-c），superoxide dismutase （SOD） and interleukin 10 （IL-10） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）.The tissue sections of mouse arterial blood vessels were made and the plaque area ratio of arterial blood vessels in each group was compared by oil red O staining.The plaque area ratio of arterial vessels in each group was compared.Results Before the treatment，compared with the control group，the level of TC，TG，LDL-c，TNF-α，IL-1β，IL-6，hs-CRP，T-AOC，MDA，MCP-1 in serum from the model group and the experimental group were significantly increased （P<0.05）；the level of HDL-c，SOD and IL-10 of that were significantly reduced （P<0.05）.After the treatment，compared with the model group，the level of TC，TG，LDL-c，TNF-α，IL-1β，IL-6，hs-CRP，T-AOC，MDA and MCP-1 in serum from the experimental group were significantly lower，and the HDL-c，SOD and IL-10 increased significantly （P<0.05）.And the area of arterial plaque decreased significantly （P<0.05）.Conclusion The Polydatin may relieve and prevent certain effect on atherosclerosis in ApoE-/- mice，reduce blood fat，inflammatory cytokines，chemokines，and increase serum immune function.

[Key words]Atherosclerosis；Polydatin；Blood lipids；Chemokines；Vascular function

心腦血管疾病是發(fā)病率較高的疾病。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導(dǎo)致心臟病、腦卒中等心腦血管疾病的主要原因[1]，其病理基礎(chǔ)為脂質(zhì)代謝紊亂、膽固醇和三酰甘油（TG）的沉積以及血管的慢性炎癥病變[2]。過(guò)量的脂質(zhì)引起細(xì)胞的凋亡，從而釋放出脂質(zhì)，形成粥樣斑塊[3-4]。在我國(guó)，隨著人口比例的老齡化趨勢(shì)，心臟病、腦卒中等疾病的發(fā)病率逐年上升，對(duì)人們的生命財(cái)產(chǎn)造成損失[5]?；⒄溶眨≒olydatin）的主要成分為白黎蘆醇和葡萄糖的結(jié)合產(chǎn)物，主要從蓼科蓼屬虎杖的根莖中提取，具有強(qiáng)心、改善微循環(huán)的功效[6-8]。本研究以ApoE-/-小鼠為對(duì)象，以高脂食物喂養(yǎng)，構(gòu)建AS模型，采用虎杖苷治療，旨在觀察虎杖苷對(duì)AS ApoE-/-小鼠血管功能的影響，探討虎杖苷對(duì)患有AS病癥小鼠的影響。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)對(duì)象

ApoE-/-小鼠品系C57/BL6，（購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司），無(wú)處理的SPF級(jí)C57/BL6小鼠與ApoE-/-小鼠無(wú)遺傳差異，體重（19.3±0.6）g，飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃。

1.2試劑和儀器

虎杖苷（Sigma，產(chǎn)品編號(hào) 15721），膽固醇（Sigma，產(chǎn)品編號(hào) 200-353-2），Leica 1900 冰凍切片機(jī)（德國(guó) Leica），酶標(biāo)儀（美國(guó) Bio-Tek）。

1.3模型建立和分組

本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)共有SPF級(jí)C57/BL6小鼠8只，ApoE-/-小鼠16只。隨機(jī)抽取的16只ApoE-/-小鼠，用普通配方飼料暫養(yǎng)1周后，投喂高脂配方飼料（含1.5%膽固醇，15.0%脂肪酸，83.5%普通飼料），連續(xù)喂養(yǎng)12周，隨機(jī)選取造模成功的8只ApoE-/-小鼠組成實(shí)驗(yàn)組，以虎杖苷藥物治療，每天灌胃0.2 g/kg；剩下8只小鼠不做治療，組成模型組。隨機(jī)選取8只無(wú)遺傳差異C57/BL6小鼠作為對(duì)照組，投喂普通飼料，并給予同等劑量的生理鹽水，治療持續(xù)16周。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

測(cè)定治療前后每組小鼠血清中的總膽固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白（LDL-c）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、超敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、高密度脂蛋白（HDL-c）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等各項(xiàng)指標(biāo)，采樣前禁食12 h，眼眶取血，離心分離后，取上清液，按照ELISA試劑盒（購(gòu)買(mǎi)于南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書(shū)的步驟檢測(cè)以上指標(biāo)。

各組給藥結(jié)束后，用乙醚麻醉小鼠后開(kāi)胸，以0.01 mol/L的PBS液經(jīng)心室灌流，取胸腔主動(dòng)脈根部，制作80張冷凍切片，每隔5張進(jìn)行油紅O染色，并做面積變量分析，用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics USA）軟件分析斑塊面積，并計(jì)算斑塊占血管面積比。

本文對(duì)動(dòng)物的處理均符合湖北省中醫(yī)院所制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1小鼠血清中脂質(zhì)含量變化的比較

模型組和實(shí)驗(yàn)組治療前的TC、TG、LDL-c水平均高于對(duì)照組，HDL-c水平低于對(duì)照組（P<0.05）。模型組治療后的TC、TG、LDL-c水平均高于治療前，HDL-c水平低于治療前（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組治療后的TC、TG、LDL-c水平均低于模型組，HDL-c水平高于模型組（P<0.05）（表1）。

表1 小鼠血清中脂質(zhì)含量的比較（g/L，x±s）

與同組治療前比較，▲P<0.05；與對(duì)照組治療前比較，*P<0.05；與模型組治療后比較，#P<0.05

2.2各組小鼠炎性細(xì)胞因子和免疫能力的比較

模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠治療前的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于對(duì)照組，IL-10水平低于對(duì)照組（P<0.05）。模型組治療后的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于治療前，IL-10水平低于治療前（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組治療后的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于模型組（P<0.05），IL-10水平高于模型組（P<0.05）（表2）。

表2 各組小鼠血清的炎性細(xì)胞因子和免疫能力的比較（ng/L，x±s）

與同組治療前比較，▲P<0.05；與對(duì)照組治療前比較，*P<0.05；與模型組治療后比較，#P<0.05

2.3血清抗氧化能力的比較

與對(duì)照組治療前比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組治療前的T-AOC和MDA含量均高于對(duì)照組，SOD低于對(duì)照組（P<0.05）。模型組小鼠治療后的T-AOC和MDA含量均高于治療前，SOD低于治療前（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組治療后的MDA低于模型組（P<0.05），SOD高于模型組（P<0.05）（表3）。

表3 各組小鼠血清抗氧化能力的比較（x±s）

與同組治療前比較，▲P<0.05；與對(duì)照組治療前比較，*P<0.05；與模型組治療后比較，#P<0.05

2.4各組小鼠血清中黏附分子的比較

與對(duì)照組治療前比較，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠治療前的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平高于對(duì)照組（P<0.05）。模型組治療后的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平均高于治療前（P<0.05）。治實(shí)驗(yàn)組治療后的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平低于模型組（P<0.05）（表4）。

2.5各組小鼠血清中趨化因子的比較

模型組和實(shí)驗(yàn)組治療前的PCT和hs-CRP水平高于對(duì)照組（P<0.05）；模型組治療后的PCT和hs-CRP水平高于治療前（P<0.05）。實(shí)驗(yàn)組治療后的PCT、hs-CRP水平低于模型組（P<0.05）（表5）。

2.6小鼠動(dòng)脈斑塊的比較

實(shí)驗(yàn)組治療后的主動(dòng)脈斑塊面積低于模型組（P<0.05）（表6）。

表6 各組小鼠主動(dòng)脈斑塊的比較（x±s）

與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3討論

動(dòng)脈血管粥樣硬化的誘因是多方面的，最主要的誘因是三酰甘油代謝紊亂，在動(dòng)脈血管粥樣硬化炎性病變的初期，內(nèi)皮功能損傷，進(jìn)而刺激機(jī)體產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β等）、黏附分子（如ICAM-1和VCAM-1等）、趨化因子（如MCP-1）等[9-10]。投喂高脂食物的ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-c和LDL-c含量均顯著升高。在虎杖苷的作用下，ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-c和LDL-c含量均顯著下降。血管的炎癥反應(yīng)可能是誘導(dǎo)AS斑塊的主要原因[11]。炎癥細(xì)胞因子能損傷內(nèi)皮，促進(jìn)蛋白溶解，降低其修復(fù)作用，增加斑塊的不穩(wěn)定性。當(dāng)小鼠血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6含量較高時(shí)，可造成血管內(nèi)膜損傷、血管痙攣，并導(dǎo)致斑塊脫落[12]。TNF-α是一種非糖基化轉(zhuǎn)膜蛋白，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的活動(dòng)，并聚集炎性細(xì)胞，促進(jìn)炎性遞質(zhì)的釋放[13]。TNF-α水平越高，則AS病癥越嚴(yán)重。周暢等[14]用虎杖苷灌胃動(dòng)脈粥樣硬化小鼠后，顯著提高了小鼠血管的抗氧化能力。本研究中，投喂高脂食物的ApoE-/-小鼠血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均顯著升高，而以虎杖苷治療后，其含量均顯著下降，提示虎杖苷對(duì)患有AS的小鼠有降脂和降低炎癥反應(yīng)的作用。SOD能清除自由基，抗氧化，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物的含量[15]。模型組小鼠血清中T-AOC和MDA顯著升高，SOD含量則顯著降低，可能是由于體內(nèi)過(guò)多的自由基消耗了SOD。以虎杖苷治療后，SOD含量升高，T-AOC和MDA含量降低，顯著提高抗氧化能力，內(nèi)皮功能顯著提高。趨化因子MCP-1與AS的形成以及斑塊的穩(wěn)定性息息相關(guān)，可為動(dòng)脈粥樣硬化的診斷依據(jù)[16-18]。本研究中，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中MCP-1含量顯著降低，動(dòng)脈粥樣硬化的程度逐漸緩解。在AS初期，吸煙、高血壓、高血脂等刺激可以激發(fā)內(nèi)皮損傷和功能障礙，并激發(fā)炎性反應(yīng)。內(nèi)皮細(xì)胞激活導(dǎo)致ICAM-1和VCAM-1等黏附因子增加。ICAM-1和VCAM-1調(diào)節(jié)白細(xì)胞在血管中的黏附能力，更加促進(jìn)內(nèi)皮的損傷。在正常血管中，ICAM-1和VCAM-1的含量非常低，而在AS形成的早期，ICAM-1和VCAM-1含量升高，與AS的病變程度有關(guān)[19-20]。實(shí)驗(yàn)組小鼠經(jīng)過(guò)虎杖苷治療后，ICAM-1和VCAM-1含量顯著降低，有效緩解內(nèi)皮功能的損傷。

綜上所述，虎杖苷通過(guò)降低血管中脂質(zhì)的含量，降低炎性細(xì)胞因子水平，調(diào)節(jié)黏附因子和趨化分子，達(dá)到對(duì)脂質(zhì)代謝紊亂造成AS的小鼠降血脂和降低血管炎癥反應(yīng)的作用，提高內(nèi)皮血管功能，有效減緩甚至防止AS的發(fā)展。

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（收稿日期：2017-12-27 本文編輯：祁海文）