李辰旭，張 許

利拉魯肽是一種人工合成的胰高血糖素樣肽－1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）類似物，用于治療Ⅱ型糖尿病（type Ⅱ diabetes mellitus，T2DM）［1］。與天然的GLP－1相比，保留了其全部生物活性，分子量為3751.2，分子結構上不同的是用精氨酸取代了第34位上的賴氨酸，第26位賴氨酸上連接了一個由谷氨酸介導的16碳棕櫚酰脂肪酸側鏈，可延長其?；a(chǎn)物與蛋白結合時間，使半衰期延長到12～14 h。利拉魯肽于2010與美國上市，現(xiàn)廣泛應用于多個國家，我國2011年底上市。本合成路線采用固相合成法，F(xiàn)moc（9－芴甲氧羰基）合成策略，載體利用Fmoc－Gly－Wang樹脂逐步縮合，最后利用制備型高效液相純化。

1 實驗儀器與試劑

自制手動合成反應器，高效液相色譜儀（島津LC－15A型，日本），電熱恒溫水浴鍋（森信實驗儀器有限公司DK－S24型，上海），臺式離心機（安亭科學儀器廠TDL80－2B型，上海），循環(huán)水式多用真空泵（長城科工貿有限公司SHB－Ⅲ型，鄭州），冷凍干燥儀（Rikakikai有限公司 FDU－1200 型，日本），全溫振蕩器（東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司HZQ－Q型，哈爾濱），ZORBAX SB－C18型色譜柱 （安捷倫，美國），哌啶（國藥集團化學試劑有限公司，上海），6－氯－1－羥基苯并三氮唑（Cl－HOBt，寶曼生物科技公司，上海），水合茚三酮（巴斯夫化工有限公司，天津），N′N－二異丙基二酰亞胺 （DIC）、 三氟乙酸（TFA）、三異丙基硅烷（TIS）購自吉爾生化，其他試劑均為市售色譜純。需要Fmoc保護的氨基酸原料17種及Fmoc－Gly－Wang樹脂（負載量為 0.27 mmol/g）均購自吉爾生化，含量均在99.3%以上：Fmoc－Arg （Pbf） －OH；Fmoc －Val－OH；Fmoc －Gly －OH；Fmoc－Leu－OH；Fmoc－Trp （Boc）－OH； Fmoc－Glu（OtBu）－OH；Fmoc－Lys（mtt）－OH；Fmoc－Gln（Trt）－OH；Fmoc－Tyr （tBu）－OH；Fmoc－Ser （tBu）－OH；Fmoc－Asp（OtBu）－OH； Fmoc－Thr（tBu）－OH；Boc－His（Trt）－OH；Fmoc－Ile－OH；Fmoc－Phe－OH；Fmoc－Glu－α－OtBu；Fmoc－Ala－OH。

2 實驗方法

2.1 試劑準備 （1）二甲基酰胺（DMF）預處理：4LDMF中加入80 g五氧化二磷 （P2O5），靜置48 h后油?。?05℃）減壓蒸餾。（2）二氧甲烷（DCM）預處理：4 L DCM原溶液加入碳酸鉀100 g，靜置48 h。（3）DIC：8 ml DIC 加處理后的 DMF 92 ml。 （4）Cl－HOBt：8.5 g Cl－HOBt加 處理后 的 DMF 溶 解至100 ml。（5）脫保護試劑：哌啶加處理后的DMF配制成25%濃度。（6）鑒定試劑：A：0.5 g茚三酮加乙醇至 10 ml；B：40 g 苯酚加乙醇 10 ml；C： 吡啶溶液。（7）切割試劑 A：TFA 5 ml+Tis 5 ml+DCM 100 ml；切割試劑B：TFA 10 ml+苯酚0.25 g+苯甲醚0.25 ml+Tis 0.25 ml+水 0.25 ml。 （8）純化及分析流動相：A：乙腈；B：水。各加入0.1%TFA。

2.2 標準固相合成 稱取 Fmoc－Gly－Wang樹脂0.1 mmol。加置反應器中加入DMF靜置0.5 h。稱取5倍樹脂量（0.5 mmol）的氨基酸。樹脂上已連接第一個氨基酸Gly，反應從第二位Arg開始，先用25%哌啶溶液洗脫樹脂的Fmoc保護基團15 min，反復2次，再依次用DMF、甲醇、DCM溶液洗滌樹脂，反復 2 次，抽干，加入 Arg、Cl－HOBt和 DIC 各 1.1 ml振蕩反應2 h。之后用DMF、甲醇、DCM溶液反復洗滌樹脂2次，抽干。按照利拉魯肽的氨基酸序列，即His－Ala－Glu－Gly－Thr－Phe－Thr－Ser－Asp－Val－Ser－Ser－Tyr－Leu－Glu－Gly－Gln－Ala－Ala－Lys* （Glu－棕櫚酸）－Glu－Phe－Ile－Ala－Trp－Leu－Val－Arg－Gly－Arg－Gly重復以上脫保護、縮合、洗滌過程。最后一個N－端氨基酸組氨酸His的保護基Boc保留在樹脂上。每次脫保護和縮合后，采用茚三酮試劑檢驗是否反應完全，取數(shù)粒樹脂，依次加入3滴茚三酮試劑 A、B、C，水?。?00℃）加熱 3 min。 保護基脫除完全的顯藍色，縮合完全的不顯色。若反應不完全，重復反應1次。

2.3 脫除Lys12上的mtt保護基，連接棕櫚酸至側鏈 反應器中加入6 ml新配的切割試劑A室溫振蕩反應5次，每次5 min，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗2次，抽干，加反應物Glu、Cl－HOBt和DIC各1.1 ml振蕩反應2 h，25%哌啶溶液適量洗脫Fmoc保護基15 min，反復2次后抽干，分別用DMF、甲醇和DCM洗滌2次后抽干，加入1 mmol棕櫚酸（256mg）、Cl－HOBt和 DIC 各 2.2 ml反應 3 h，洗滌后抽干。

2.4 切割樹脂 加入切割試劑B混勻后放置2 h，期間震蕩幾次，取濾液置于50 ml離心管中，取事先冰水中冷卻的無水乙醚加入離心管至45 ml以上，混勻充分后置于冰中冷卻0.5 h。分裝后置于離心機，離心后棄去上清液，加適量乙醚洗滌下層多肽沉淀2～3次，剩余粗肽置于室溫空氣干燥。最終稱量粗品332.7 mg，粗肽收率為88.7%。粗品高效液相色譜（流動相：水→90%乙腈梯度洗脫）見圖1。

2.5 純化 將醋酸、乙腈和水按3∶3∶4配置，溶解粗肽，離心后取上清液。采用安捷倫ZORBAX SB－C18型半制備色譜柱（9.4×250 mm）梯度洗脫。波長：220 nm；流速：4 ml/min；進樣量：1 ml；洗脫梯度：初始流動相A占15%，5 min內A的比例升到30%，25 min內再由30%升到50%，50%持續(xù)10 min，再在10 min內升到100%后繼續(xù)10 min。此條件下產(chǎn)物峰出現(xiàn)在33 min左右，收集產(chǎn)物后冷凍干燥得純品39.4 mg，收率為10.5%。

2.6 鑒定 高效液相及質譜鑒定利拉魯肽。液相使用安捷倫 ZORBAX SB－C18型分析色譜柱 （4.6×250 mm），波長 220 nm；流速 1 ml/min；進樣量：20μl；洗脫梯度：初始流動相A30%，10 min內A的比例升到70%，保持70%持續(xù)10 min，再與10 min內升到100%繼續(xù)保持10 min。純化后的利拉魯肽HPLC圖譜見圖2。質譜采用ESI正離子模式，霧化氣體流速1.5 L/min，脫溶劑氣溫度250℃，毛細管電壓4.5 kv。質譜鑒定結果圖譜見圖3。

結果表明，利拉魯肽的純度為93.5%（歸一化法），計算分子量結果：938.85 對應［M+4H］4+峰，結果 M=3751.4；758.85 對應［M+5H+K］5+峰，結果 M=3751.25；1251.5 對應［M+3H］3+峰，結算 M=3751.5。與利拉魯肽分子量3751相符，可以確定得到的純品為利拉魯肽。

圖1 利拉魯肽粗品HPLC圖

圖2 利拉魯肽純品HPLC圖

圖3 利拉魯肽質譜圖

3 討論

固相合成法制備多肽，因其可省去每步反應的后處理操作，省時、省力，已成為肽合成的常規(guī)方法。與生物制藥工程相比，固相合成產(chǎn)品具有產(chǎn)率高，雜質少的特點，但在實際操作中仍然涉及改良以進一步提高產(chǎn)率［2］。目前固相合成主要采用Boc法和Fmoc法。Boc策略用酸來脫保護容易損失樹脂，還會引起側鏈的一些不良反應，且不適合含色氨酸等對酸不穩(wěn)定的氨基酸。Fmoc策略在堿性條件下可以迅速脫除，條件比較溫和，因此本實驗選用Fmoc策略。合成多肽切忌試劑中含水，因此實驗前需將所用試劑重蒸處理。切割試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，以免放置過程中吸水或者揮發(fā)。在縮合反應中較難連接的為直鏈中的Gln、Gly、Glu和最后的His。采用兩次縮合后效果較好，Asp顯色不明顯，延長反應時間?，F(xiàn)許多實驗室合成多肽使用多肽合成儀，使用方便且節(jié)省人力，本實驗主要為確定合成路線及反應條件，使用手動反應器雖然工作量大，但方便每步反應監(jiān)測，下一步會進行中試擴大試驗。因設備條件有限，采用半制備型高效液相純化時進樣量少，但可為今后的擴大試驗提供條件。

以往治療糖尿病多側重于控制血糖，往往忽略對胰島功能的保護，最終導致多數(shù)患者β細胞功能進一步衰退。有文獻報道當患者確診為糖尿病時，其β細胞功能受損已達到50%［3］，飲食控制及常用的降糖藥無法延緩疾病對β細胞的受損［4］。研究表明GLP－1類似物利拉魯肽不僅能促進胰島素分泌、抑制胰高血糖素的生成、還具有刺激胰島β細胞增殖、分化及抑制凋亡等生理功能［5］。另外利拉魯肽在其他方面的研究也多有報道，如參與脂肪組織的糖脂代謝，調節(jié)脂肪細胞因子的生成，用于治療單純性肥胖［1］。利拉魯肽自上市以來已取得巨大的收益和良好的評價，但價格高，工業(yè)生產(chǎn)方法有待改進。目前國內已有合成報道［6］，但與本方法不同。鑒于利拉魯肽的優(yōu)勢，探索其新的合成方法以提高產(chǎn)率降低成本具有現(xiàn)實意義。

［1］ IEPSEN EW，TOREKOV SS，HOLST JJ.Liraglutide for Type 2 diabetes and obesity：a 2015 update［J］.Expert Rev Cardiovasc Ther，2015，13（7）：753－767.

［2］ GURYANOV I，BONDESAN A，VISENTINI D1，et al.Innovative chemical synthesis and conformational hints on the lipopeptide liraglutide［J］.J Pept Sci，2016，22（7）：471－479.

［3］ DEL PRATO S，MARCHETTI P.Beta－and alpha－cell dysfunction in type 2 diabetes［J］.Horm Metab Res，2004，36（11/12）：775－781.

［4］ PANENI F，LüSCHER TF.Cardiovascular Protection in the Treatment of Type 2 Diabetes：A review of clinical trial results across drug classes［J］.Am J Cardiol，2017，120（1S）：S17－S27.

［5］ STUDS J，GOFFREDSEN CF，ROMER J，et al.GLP－1 derivative liraglutide in rats with beta－cell deficiencies：influence of metabolic state on beta－cell mass dynamics［J］.Br J Pharmacol，2003，140（1）：123－132.

［6］馬艷池，東圓珍，張喜，等.利拉魯肽的制備［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（2）：121－124.