李辰旭，張 許

利拉魯肽是一種人工合成的胰高血糖素樣肽－1（glucagon－like peptide－1，GLP－1）類(lèi)似物，用于治療Ⅱ型糖尿病（type Ⅱ diabetes mellitus，T2DM）［1］。與天然的GLP－1相比，保留了其全部生物活性，分子量為3751.2，分子結(jié)構(gòu)上不同的是用精氨酸取代了第34位上的賴(lài)氨酸，第26位賴(lài)氨酸上連接了一個(gè)由谷氨酸介導(dǎo)的16碳棕櫚酰脂肪酸側(cè)鏈，可延長(zhǎng)其酰化產(chǎn)物與蛋白結(jié)合時(shí)間，使半衰期延長(zhǎng)到12～14 h。利拉魯肽于2010與美國(guó)上市，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于多個(gè)國(guó)家，我國(guó)2011年底上市。本合成路線(xiàn)采用固相合成法，F(xiàn)moc（9－芴甲氧羰基）合成策略，載體利用Fmoc－Gly－Wang樹(shù)脂逐步縮合，最后利用制備型高效液相純化。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

自制手動(dòng)合成反應(yīng)器，高效液相色譜儀（島津LC－15A型，日本），電熱恒溫水浴鍋（森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司DK－S24型，上海），臺(tái)式離心機(jī)（安亭科學(xué)儀器廠TDL80－2B型，上海），循環(huán)水式多用真空泵（長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司SHB－Ⅲ型，鄭州），冷凍干燥儀（Rikakikai有限公司 FDU－1200 型，日本），全溫振蕩器（東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司HZQ－Q型，哈爾濱），ZORBAX SB－C18型色譜柱 （安捷倫，美國(guó)），哌啶（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海），6－氯－1－羥基苯并三氮唑（Cl－HOBt，寶曼生物科技公司，上海），水合茚三酮（巴斯夫化工有限公司，天津），N′N(xiāo)－二異丙基二酰亞胺 （DIC）、 三氟乙酸（TFA）、三異丙基硅烷（TIS）購(gòu)自吉爾生化，其他試劑均為市售色譜純。需要Fmoc保護(hù)的氨基酸原料17種及Fmoc－Gly－Wang樹(shù)脂（負(fù)載量為 0.27 mmol/g）均購(gòu)自吉爾生化，含量均在99.3%以上：Fmoc－Arg （Pbf） －OH；Fmoc －Val－OH；Fmoc －Gly －OH；Fmoc－Leu－OH；Fmoc－Trp （Boc）－OH； Fmoc－Glu（OtBu）－OH；Fmoc－Lys（mtt）－OH；Fmoc－Gln（Trt）－OH；Fmoc－Tyr （tBu）－OH；Fmoc－Ser （tBu）－OH；Fmoc－Asp（OtBu）－OH； Fmoc－Thr（tBu）－OH；Boc－His（Trt）－OH；Fmoc－Ile－OH；Fmoc－Phe－OH；Fmoc－Glu－α－OtBu；Fmoc－Ala－OH。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 試劑準(zhǔn)備 （1）二甲基酰胺（DMF）預(yù)處理：4LDMF中加入80 g五氧化二磷 （P2O5），靜置48 h后油?。?05℃）減壓蒸餾。（2）二氧甲烷（DCM）預(yù)處理：4 L DCM原溶液加入碳酸鉀100 g，靜置48 h。（3）DIC：8 ml DIC 加處理后的 DMF 92 ml。 （4）Cl－HOBt：8.5 g Cl－HOBt加 處理后 的 DMF 溶 解至100 ml。（5）脫保護(hù)試劑：哌啶加處理后的DMF配制成25%濃度。（6）鑒定試劑：A：0.5 g茚三酮加乙醇至 10 ml；B：40 g 苯酚加乙醇 10 ml；C： 吡啶溶液。（7）切割試劑 A：TFA 5 ml+Tis 5 ml+DCM 100 ml；切割試劑B：TFA 10 ml+苯酚0.25 g+苯甲醚0.25 ml+Tis 0.25 ml+水 0.25 ml。 （8）純化及分析流動(dòng)相：A：乙腈；B：水。各加入0.1%TFA。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)固相合成 稱(chēng)取 Fmoc－Gly－Wang樹(shù)脂0.1 mmol。加置反應(yīng)器中加入DMF靜置0.5 h。稱(chēng)取5倍樹(shù)脂量（0.5 mmol）的氨基酸。樹(shù)脂上已連接第一個(gè)氨基酸Gly，反應(yīng)從第二位Arg開(kāi)始，先用25%哌啶溶液洗脫樹(shù)脂的Fmoc保護(hù)基團(tuán)15 min，反復(fù)2次，再依次用DMF、甲醇、DCM溶液洗滌樹(shù)脂，反復(fù) 2 次，抽干，加入 Arg、Cl－HOBt和 DIC 各 1.1 ml振蕩反應(yīng)2 h。之后用DMF、甲醇、DCM溶液反復(fù)洗滌樹(shù)脂2次，抽干。按照利拉魯肽的氨基酸序列，即His－Ala－Glu－Gly－Thr－Phe－Thr－Ser－Asp－Val－Ser－Ser－Tyr－Leu－Glu－Gly－Gln－Ala－Ala－Lys* （Glu－棕櫚酸）－Glu－Phe－Ile－Ala－Trp－Leu－Val－Arg－Gly－Arg－Gly重復(fù)以上脫保護(hù)、縮合、洗滌過(guò)程。最后一個(gè)N－端氨基酸組氨酸His的保護(hù)基Boc保留在樹(shù)脂上。每次脫保護(hù)和縮合后，采用茚三酮試劑檢驗(yàn)是否反應(yīng)完全，取數(shù)粒樹(shù)脂，依次加入3滴茚三酮試劑 A、B、C，水浴（100℃）加熱 3 min。 保護(hù)基脫除完全的顯藍(lán)色，縮合完全的不顯色。若反應(yīng)不完全，重復(fù)反應(yīng)1次。

2.3 脫除Lys12上的mtt保護(hù)基，連接棕櫚酸至側(cè)鏈 反應(yīng)器中加入6 ml新配的切割試劑A室溫振蕩反應(yīng)5次，每次5 min，依次用DCM、甲醇、DMF、DCM各洗2次，抽干，加反應(yīng)物Glu、Cl－HOBt和DIC各1.1 ml振蕩反應(yīng)2 h，25%哌啶溶液適量洗脫Fmoc保護(hù)基15 min，反復(fù)2次后抽干，分別用DMF、甲醇和DCM洗滌2次后抽干，加入1 mmol棕櫚酸（256mg）、Cl－HOBt和 DIC 各 2.2 ml反應(yīng) 3 h，洗滌后抽干。

2.4 切割樹(shù)脂 加入切割試劑B混勻后放置2 h，期間震蕩幾次，取濾液置于50 ml離心管中，取事先冰水中冷卻的無(wú)水乙醚加入離心管至45 ml以上，混勻充分后置于冰中冷卻0.5 h。分裝后置于離心機(jī)，離心后棄去上清液，加適量乙醚洗滌下層多肽沉淀2～3次，剩余粗肽置于室溫空氣干燥。最終稱(chēng)量粗品332.7 mg，粗肽收率為88.7%。粗品高效液相色譜（流動(dòng)相：水→90%乙腈梯度洗脫）見(jiàn)圖1。

2.5 純化 將醋酸、乙腈和水按3∶3∶4配置，溶解粗肽，離心后取上清液。采用安捷倫ZORBAX SB－C18型半制備色譜柱（9.4×250 mm）梯度洗脫。波長(zhǎng)：220 nm；流速：4 ml/min；進(jìn)樣量：1 ml；洗脫梯度：初始流動(dòng)相A占15%，5 min內(nèi)A的比例升到30%，25 min內(nèi)再由30%升到50%，50%持續(xù)10 min，再在10 min內(nèi)升到100%后繼續(xù)10 min。此條件下產(chǎn)物峰出現(xiàn)在33 min左右，收集產(chǎn)物后冷凍干燥得純品39.4 mg，收率為10.5%。

2.6 鑒定 高效液相及質(zhì)譜鑒定利拉魯肽。液相使用安捷倫 ZORBAX SB－C18型分析色譜柱 （4.6×250 mm），波長(zhǎng) 220 nm；流速 1 ml/min；進(jìn)樣量：20μl；洗脫梯度：初始流動(dòng)相A30%，10 min內(nèi)A的比例升到70%，保持70%持續(xù)10 min，再與10 min內(nèi)升到100%繼續(xù)保持10 min。純化后的利拉魯肽HPLC圖譜見(jiàn)圖2。質(zhì)譜采用ESI正離子模式，霧化氣體流速1.5 L/min，脫溶劑氣溫度250℃，毛細(xì)管電壓4.5 kv。質(zhì)譜鑒定結(jié)果圖譜見(jiàn)圖3。

結(jié)果表明，利拉魯肽的純度為93.5%（歸一化法），計(jì)算分子量結(jié)果：938.85 對(duì)應(yīng)［M+4H］4+峰，結(jié)果 M=3751.4；758.85 對(duì)應(yīng)［M+5H+K］5+峰，結(jié)果 M=3751.25；1251.5 對(duì)應(yīng)［M+3H］3+峰，結(jié)算 M=3751.5。與利拉魯肽分子量3751相符，可以確定得到的純品為利拉魯肽。

圖1 利拉魯肽粗品HPLC圖

圖2 利拉魯肽純品HPLC圖

圖3 利拉魯肽質(zhì)譜圖

3 討論

固相合成法制備多肽，因其可省去每步反應(yīng)的后處理操作，省時(shí)、省力，已成為肽合成的常規(guī)方法。與生物制藥工程相比，固相合成產(chǎn)品具有產(chǎn)率高，雜質(zhì)少的特點(diǎn)，但在實(shí)際操作中仍然涉及改良以進(jìn)一步提高產(chǎn)率［2］。目前固相合成主要采用Boc法和Fmoc法。Boc策略用酸來(lái)脫保護(hù)容易損失樹(shù)脂，還會(huì)引起側(cè)鏈的一些不良反應(yīng)，且不適合含色氨酸等對(duì)酸不穩(wěn)定的氨基酸。Fmoc策略在堿性條件下可以迅速脫除，條件比較溫和，因此本實(shí)驗(yàn)選用Fmoc策略。合成多肽切忌試劑中含水，因此實(shí)驗(yàn)前需將所用試劑重蒸處理。切割試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，以免放置過(guò)程中吸水或者揮發(fā)。在縮合反應(yīng)中較難連接的為直鏈中的Gln、Gly、Glu和最后的His。采用兩次縮合后效果較好，Asp顯色不明顯，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間?，F(xiàn)許多實(shí)驗(yàn)室合成多肽使用多肽合成儀，使用方便且節(jié)省人力，本實(shí)驗(yàn)主要為確定合成路線(xiàn)及反應(yīng)條件，使用手動(dòng)反應(yīng)器雖然工作量大，但方便每步反應(yīng)監(jiān)測(cè)，下一步會(huì)進(jìn)行中試擴(kuò)大試驗(yàn)。因設(shè)備條件有限，采用半制備型高效液相純化時(shí)進(jìn)樣量少，但可為今后的擴(kuò)大試驗(yàn)提供條件。

以往治療糖尿病多側(cè)重于控制血糖，往往忽略對(duì)胰島功能的保護(hù)，最終導(dǎo)致多數(shù)患者β細(xì)胞功能進(jìn)一步衰退。有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)患者確診為糖尿病時(shí)，其β細(xì)胞功能受損已達(dá)到50%［3］，飲食控制及常用的降糖藥無(wú)法延緩疾病對(duì)β細(xì)胞的受損［4］。研究表明GLP－1類(lèi)似物利拉魯肽不僅能促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素的生成、還具有刺激胰島β細(xì)胞增殖、分化及抑制凋亡等生理功能［5］。另外利拉魯肽在其他方面的研究也多有報(bào)道，如參與脂肪組織的糖脂代謝，調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞因子的生成，用于治療單純性肥胖［1］。利拉魯肽自上市以來(lái)已取得巨大的收益和良好的評(píng)價(jià)，但價(jià)格高，工業(yè)生產(chǎn)方法有待改進(jìn)。目前國(guó)內(nèi)已有合成報(bào)道［6］，但與本方法不同。鑒于利拉魯肽的優(yōu)勢(shì)，探索其新的合成方法以提高產(chǎn)率降低成本具有現(xiàn)實(shí)意義。

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［6］馬艷池，東圓珍，張喜，等.利拉魯肽的制備［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（2）：121－124.