張宏展，陳培林，李觀貴，孫青，熊風(fēng)，萬(wàn)才云，黃菊，曾勇*

(1.深圳中山泌尿外科醫(yī)院生殖中心，深圳市圍著床期生殖免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳 518045；2. 深圳中山生殖與遺傳研究所，深圳 518045)

通過(guò)對(duì)存在受精失敗高風(fēng)險(xiǎn)的患者行早期觀察治療，并對(duì)未出現(xiàn)第二極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子注射(早期補(bǔ)救ICSI)，是目前國(guó)內(nèi)輔助生殖避免受精失敗的常用方法[1]。盡管大量數(shù)據(jù)已經(jīng)證明該方法在避免受精失敗方面十分有效[2-4]，但是行早期補(bǔ)救ICSI可能會(huì)引起異常受精率的增加[2，5]，同時(shí)給患者帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力，而較高的早補(bǔ)率還會(huì)增加胚胎學(xué)家的工作負(fù)擔(dān)。因此若能通過(guò)某些參數(shù)篩選出早期觀察治療患者中可能存在受精失敗高風(fēng)險(xiǎn)的人群，并對(duì)這部分人群的治療方案進(jìn)行改進(jìn)，無(wú)論對(duì)患者還是對(duì)胚胎培養(yǎng)室的工作都是有利的。

正常形態(tài)前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)(TNNPS)包含精子數(shù)量、精子前向運(yùn)動(dòng)能力以及精子形態(tài)學(xué)等信息[6]，已被證明與輔助生殖受精結(jié)局相關(guān)[6-9]，因此有潛力成為預(yù)測(cè)早期觀察治療患者受精失敗的參數(shù)。本研究探討利用TNNPS預(yù)測(cè)早期觀察受精失敗的可能性，并報(bào)道如下。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2013年1月1日至2016年3月31日于本生殖中心行早期觀察治療的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)第1治療周期；(2)促排卵方案為標(biāo)準(zhǔn)方案或常規(guī)長(zhǎng)方案。共計(jì)2 768例。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，并且得到入選患者的知情同意。

二、研究方法

1.分組：將所有研究對(duì)象按TNNPS從小到大排序，根據(jù)排序的第25、50、75三個(gè)百分位點(diǎn)將研究對(duì)象分為4組，各692例，分別為A組：TNNPS≤2.76×106；B組：2.76×106

2.術(shù)前精液檢測(cè)：參考WHO第5版手冊(cè)[10]的標(biāo)準(zhǔn)化程序進(jìn)行精液的采集及處理，采用Makler計(jì)數(shù)池(Sefi-Makeler，以色列)載樣在SCA計(jì)算機(jī)輔助精液分析操作系統(tǒng)(Microptic，西班牙)下同時(shí)進(jìn)行精子濃度及活力分析；精子形態(tài)學(xué)分析采用Diff-Quik快速染色液(Medion Diagnostics，瑞士)染色，根據(jù)WHO第5版手冊(cè)的精子形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行人工分析。

3.術(shù)前精液處理：男方禁欲3～7 d，于取卵日以手淫法取精，室溫液化后，記錄精液量、液化時(shí)間。密度梯度離心法處理精子，并采用CASA操作系統(tǒng)檢測(cè)精子濃度、活動(dòng)率、前向運(yùn)動(dòng)精子比例，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中備用。

4.指標(biāo)參數(shù)計(jì)算：TNNPS=精液體積(ml)×精子濃度(106/ml)×正常形態(tài)精子百分比(%)×前向運(yùn)動(dòng)精子百分比(%)。

5.控制性促排卵和卵母細(xì)胞收集：促排卵采用本中心標(biāo)準(zhǔn)方案、常規(guī)長(zhǎng)方案，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)，注射后34～36 h左右行陰道B超穿刺取卵，卵母細(xì)胞放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)直至授精。

6.早期觀察：卵母細(xì)胞培養(yǎng)3～5 h后授精，加入精子量為每個(gè)卵母細(xì)胞1萬(wàn)個(gè)精子。受精后4 h去除卵丘細(xì)胞，觀察第二極體排出情況，若4 h時(shí)出現(xiàn)第二極體卵母細(xì)胞≤30%，延長(zhǎng)觀察時(shí)間至6 h，若此時(shí)出現(xiàn)第二極體卵母細(xì)胞≤50%，則定義為受精失敗，補(bǔ)行ICSI。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、所有入選患者不同TNNPS分組一般資料比較

A、B、C、D組患者一般資料如女方年齡、男方年齡、不育年限、平均獲卵數(shù)及女方體重指數(shù)(BMI)等均無(wú)顯著性差異(P0.05)(表1)。

表1 所有入選患者各組一般臨床資料(-±s)

二、所有入選患者不同TNNPS分組受精失敗率比較

對(duì)不同TNNPS組患者的受精失敗率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，B、C、D 3組的受精失敗率無(wú)顯著性差異(P0.05)，而A組的受精失敗率顯著高于B、C、D組(P<0.05)(表2)。

表2 所有入選患者各組患者受精失敗率比較(%)

注：與A組比較，*P<0.05

三、TNNPS≤3.0×106的各組患者一般資料比較

TNNPS≤3.0×106的研究對(duì)象共751例，以0.5×106為單位細(xì)分為6組，Ⅰ～Ⅵ組患者一般資料如女方年齡、男方年齡、不育年限、平均獲卵數(shù)及女方BMI等無(wú)顯著性差異(P0.05)(表3)。

四、TNNPS≤3.0×106的各組患者受精失敗率比較

對(duì)TNNPS≤3.0×106的各組患者的受精失敗率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ 4組的受精失敗率無(wú)顯著性差異(P0.05)，而Ⅰ組、Ⅱ組受精失敗率均顯著高于其他4組(P<0.05)(表4)。

五、多因素Logistic回歸分析

以受精失敗為因變量，以女方年齡、男方年齡、不育年限、平均獲卵數(shù)、女方BMI、TNNPS≤1.0×106做多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示女方年齡、男方年齡、不育年限、平均獲卵數(shù)、女方BMI對(duì)早期觀察受精失敗的發(fā)生均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而TNNPS≤1.0×106[OR=25.422，95%CI(17.702-36.508)]對(duì)早期觀察受精失敗的發(fā)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即TNNPS≤1.0×106時(shí)早期觀察受精失敗的概率較高(表5)。

表3 TNNPS≤3.0×106的各組患者一般資料比較(-±s)

表4 TNNPS≤3.0×106的各組患者受精失敗率比較(%)

注：與Ⅰ、Ⅱ組比較，*P<0.05

表5 多因素Logistic回歸分析各因素對(duì)早期觀察受精失敗的影響

討 論

輔助生殖治療過(guò)程中存在著受精失敗的風(fēng)險(xiǎn)[11-12]，目前大量研究及臨床信息證明對(duì)短時(shí)受精早期觀察未出現(xiàn)第二極體的卵母細(xì)胞行早期補(bǔ)救ICSI，可以得到良好的胚胎培養(yǎng)結(jié)局和妊娠結(jié)局，是避免受精失敗的有效手段[13-16]。盡管早期補(bǔ)救ICSI在避免受精失敗方面效果顯著，但有研究認(rèn)為短時(shí)受精因?yàn)樘嵩缛コw粒細(xì)胞，干擾了正常受精，可能導(dǎo)致異常受精率增加[2，5]。而且由于需要承擔(dān)短時(shí)受精和早期補(bǔ)救ICSI兩部分費(fèi)用，使這部分患者承受了更大的經(jīng)濟(jì)和精神壓力，同時(shí)，較高的早補(bǔ)率也增加了胚胎培養(yǎng)室的工作壓力，因此有必要找到一個(gè)指標(biāo)將短時(shí)受精早期觀察治療方案患者中受精失敗高風(fēng)險(xiǎn)人群篩選出來(lái)，并對(duì)這部分人群的治療方案進(jìn)行改進(jìn)。

TNNPS包含眾多精液相關(guān)信息，有潛力成為一個(gè)獨(dú)立的精液質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)指導(dǎo)輔助生殖[7]。張?jiān)粕降萚6]的研究證明，TNNPS與宮腔內(nèi)人工授精(IUI)臨床妊娠結(jié)局關(guān)系密切；孫青等[9]的研究則表明，TNNPS對(duì)于IVF受精結(jié)局具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值；而蔡靖等[7]的研究證明當(dāng)TNNPS≤1.8×106時(shí)，IVF存在著較高的低受精風(fēng)險(xiǎn)。盡管這些研究的側(cè)重點(diǎn)不同，但均可以說(shuō)明TNNPS與IVF受精結(jié)局密切相關(guān)，因此我們猜想TNNPS可能與早期觀察治療患者的受精失敗率存在一定的關(guān)系，進(jìn)而有可能成為預(yù)測(cè)早期觀察受精失敗的參數(shù)。

為了驗(yàn)證我們的猜想，我們回顧性分析了2013年1月1日至2016年3月31日在我院行早期觀察治療的2 768個(gè)周期。所有入選患者按照TNNPS的不同分成4組，比較各組患者的一般臨床資料和受精失敗率。結(jié)果顯示，不同TNNPS的4組患者女方年齡、男方年齡、不育年限、平均獲卵數(shù)及女方BMI等無(wú)顯著性差異(P0.05)，但是TNNPS≤2.76×106的受精失敗率達(dá)到23.27%，顯著高于其他3組，這預(yù)示著TNNPS≤2.76×106組患者存在著更高的受精失敗風(fēng)險(xiǎn)。

由于A組TNNPS為0～2.76×106，范圍較大，為了提高研究的精確性，我們將TNNPS≤3.0×106的751例患者，以0.5×106為基本單位細(xì)分為6組，并比較各組患者的一般臨床資料和受精失敗率。結(jié)果顯示，6組患者一般臨床資料均無(wú)顯著性差異(P0.05)，對(duì)于TNNPS>1.0×106的4組患者，受精失敗率分別為12.84%、14.04%、16.50%、11.34%，兩兩之間比較也無(wú)顯著性差異(P0.05)，而TNNPS≤1.0×106的兩組患者受精失敗率分別高達(dá)43.31%和28.79%，均顯著高于TNNPS>1.0×106的4組患者(P<0.05)。多因素Logistic回歸分析顯示TNNPS≤1.0×106是影響早期觀察受精失敗的重要獨(dú)立因子，當(dāng)早期觀察患者TNNPS≤1.0×106時(shí)受精失敗風(fēng)險(xiǎn)增加。

綜上所述，在行早期觀察治療方案的患者中，TNNPS與受精結(jié)局有一定的相關(guān)性，低TNNPS對(duì)受精失敗有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。其中TNNPS≤1.0×106的人群受精失敗的可能性較大，建議對(duì)這部分患者改行ICSI治療方案以得到更好的受精結(jié)局，同時(shí)減輕這部分患者的經(jīng)濟(jì)和精神壓力，以及胚胎學(xué)家的工作壓力。

【參 考 文 獻(xiàn)】

[1] 譚艷，龍文香，李娟娟，等. 早期補(bǔ)救性ICSI新生兒近期安全性的Meta分析[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2017，26：983-988.

[2] 陳智勤，潘家坪，滕曉明，等. 比較短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救ICSI與常規(guī)IVF在不明原因性不孕治療的結(jié)局[J].生殖與避孕，2013，33：665-671.

[3] 張寧媛，孫海翔，胡婭莉，等. 短時(shí)受精聯(lián)合早期補(bǔ)救性卵細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)單精子注射在完全受精失敗周期的臨床應(yīng)用[J].中華男科學(xué)雜志，2009，15：538-541.

[4] 王雄，郝翠芳. 短時(shí)體外受精及時(shí)補(bǔ)救ICSI的臨床應(yīng)用[J].生殖與避孕，2009，29：399-341.

[5] 張微，宋成，成金泉，等. 卵子受精早期現(xiàn)象的初步探討[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18：197-202.

[6] 張?jiān)粕?，韋冰，陳碧，等. 正常形態(tài)前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)對(duì)IUI臨床周期妊娠率的影響[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2013，8：14-16.

[7] 蔡靖，尹彪，劉紅杰，等. 正常形態(tài)前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)與體外受精結(jié)局關(guān)系的探討[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2013，22：329-333.

[8] 高彩鳳，余相，陳志云，等.正常形態(tài)前向運(yùn)動(dòng)精子總數(shù)對(duì)體外受精受精率的影響[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2015，14：1382-1414.

[9] 孫青，李觀貴，熊風(fēng)，等. 常規(guī)精液檢查及優(yōu)化處理后的精液參數(shù)對(duì)常規(guī)IVF受精結(jié)局的預(yù)測(cè)價(jià)值[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2016，25：787-793.

[10] WHO.世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)[S]. 第5版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：7-96.

[11] Lipitz S，Rabinovici J，Goldenberg M，et al. Complete failure of fertilization in couples with mechanical infertility：implications for subsequent cycles[J].Fertil Steril，1994，61：863-866.

[12] Gurgan T，Urman B，Yarali H，et al. The results of in vitro fertilization-embryo transfer in couples with unexplained infertility failing to conceive with superovulation and intrauterine insemination[J].Fertil Steril，1995，64：93-97.

[13] Chen C，Kattera S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h post-insemination in conventional IVF[J].Hum Reprod，2003，18：2118-2121.

[14] 孫海翔. 早期補(bǔ)救ICSI的安全性和應(yīng)用價(jià)值[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志，2009，18：195-197.

[15] 吳麗敏，童先宏，劉雨生，等. Half-ICSI與備早補(bǔ)救ICSI在可疑體外受精周期失敗中的應(yīng)用[J].生殖與避孕，2011，31：415-419.

[16] Xiong S，Han W，Liu JX，et al. Effects of cumuluscellsremoval after 6 h co-incubation of gametes on the outcomes of human IVF[J].J Assist Reprod Genet，2011，28：1205-1211.