朱楠，黃小圓，李金晶，葛紅山，2*

(1.溫州醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，溫州 325000；2.泰州市人民醫(yī)院，泰州 225300)

隨著二胎政策的全面開放，女性生育年齡普遍推遲。研究表明，女性生育能力在經(jīng)歷21～25歲的生育高峰后，開始逐漸下降，至35歲后發(fā)生急劇下降[1]。卵巢作為一種長壽命組織，其衰老的發(fā)生早于機體的衰老。卵巢衰老引起的女性不孕及內(nèi)分泌紊亂等問題已成為影響女性生活質(zhì)量的重要因素。卵巢衰老主要表現(xiàn)為卵泡數(shù)目的減少和卵母細(xì)胞質(zhì)量的下降[2]。作為卵巢中數(shù)量最多的卵泡，原始卵泡的激活貫穿于整個生育階段，且直接影響卵泡的數(shù)量，是決定卵巢儲備能力的重要因素[3]。原始卵泡處于減數(shù)分裂前期的雙線期，它由單層扁平的顆粒細(xì)胞包繞初級卵母細(xì)胞而形成[3]。1992年，Hirshfield[4]提出將原始卵泡分為“第一波原始卵泡”和“成年原始卵泡”，前者位于卵巢髓質(zhì)部，形成后立即啟動；后者位于卵巢皮質(zhì)部，形成后一直保持靜息狀態(tài)，成年期開始分批啟動。目前這一觀點被越來越多實驗結(jié)果所支持。

卵巢衰老的具體機制目前尚不明確。最近的研究認(rèn)為，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)與卵巢衰老密切相關(guān)[5]。AGEs是對非酶糖基化反應(yīng)(Mailland反應(yīng))終末產(chǎn)物的總稱，在人體的長壽命組織和器官中發(fā)生增齡性積累，與蛋白直接交聯(lián)引起相關(guān)蛋白的變性失活，同時還可與AGEs受體(RAGE)結(jié)合形成AGEs-RAGE軸介導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激和羰基應(yīng)激，是研究衰老的重要指標(biāo)之一[6]。研究表明，AGEs引起的損傷對配子的形成、胚胎著床、胚胎發(fā)育等人類各個生殖階段均產(chǎn)生重要的影響[7]，即AGEs在卵巢中堆積會加速卵巢衰老的發(fā)生[8]。本實驗主要研究AGEs是否會通過影響原始卵泡激活從而引起卵巢衰老的發(fā)生。

材料與方法

一、材料和動物

1.動物：成年 ICR小鼠購自溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。以雄雌比例1∶2合籠，次日檢查陰道栓確認(rèn)妊娠，單籠飼養(yǎng)直至分娩獲得4日齡乳鼠。

2.試劑：AGE-BSA制劑(10 mg/ml)購于美國Merck Millipore公司，培養(yǎng)小室購于美國Millipore公司；DEME/F12(1∶1)培養(yǎng)基、Albumax、青/鏈霉素雙抗購于美國Gibco公司；L-ascorbic acid、ITS購于日本Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、HE染料試劑盒、BCA試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗RAGE多克隆抗體購于美國Abcam公司、羊抗細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)多克隆抗體購于美國Santa cruz公司，兔抗β-actin多克隆抗體購于美國Bioworld公司，HRP標(biāo)記的山羊抗兔、兔抗山羊二抗購自美國Biosharp公司；DAB顯色試劑盒、兔二步法檢測試劑盒、山羊超敏檢測試劑盒購自中杉金橋。

二、方法

1.卵巢培養(yǎng)：將實驗組分為空白對照組、溶劑對照組、AGE-BSA組。其中，空白對照組以DEME/F12(1∶1)為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其內(nèi)加入1‰ BSA、1‰ Albumax、0.05 mg/ml L-ascorbic acid、1%ITS和1‰青/鏈霉素雙抗；溶劑對照組使用的培養(yǎng)液是在空白對照組培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上添加200 μg/ml BSA；AGE-BSA組培養(yǎng)液則是在空白對照組培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上將購買的10 mg/ml AGE-BSA配制成200 μg/ml AGE-BSA終濃度。取200只4日齡雌性乳鼠為實驗對象，解剖顯微鏡下完整剝離乳鼠卵巢，將其隨機轉(zhuǎn)移至各組培養(yǎng)小室內(nèi)(3顆/室)，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，隔日換半液，4 d后收集各組卵巢。

2.HE染色：各組收集的卵巢用4%多聚甲醛固定過夜(12～24 h)，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后，選取最大橫截面進(jìn)行切片。將切片置于65℃烤箱內(nèi)烘烤1 h，二甲苯脫蠟、梯度酒精(100%、95%、75%、蒸餾水)中各5 min，滴加蘇木素染料浸染5 min，自來水下返藍(lán)15 min，伊紅染料浸染2 min，然后經(jīng)梯度酒精脫水(95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%)、二甲苯透明各5 min后封片；鏡下計數(shù)各級卵泡數(shù)量，分析比較各組中原始卵泡和生長卵泡[9](包括初級卵泡和次級卵泡)構(gòu)成比。本實驗中不計數(shù)成熟卵泡和閉鎖卵泡。

3.免疫蛋白印跡(Western Blot)：收集各組培養(yǎng)4 d后的卵巢組織，每組每批使用30個卵巢，重復(fù)3次，分組分批提取總蛋白，BCA試劑盒測量各組蛋白濃度；將抽提蛋白按每孔25 μl在12% SDS-PAGE電泳，然后將分離的目的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉-TBST搖床上室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，分別加入對應(yīng)的一抗[RAGE抗體(1∶1 000)、PCNA抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶2 500)]4℃搖床孵育過夜；次日，PVDF膜用TBST洗滌3次，每次5 min，分別與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)、兔抗山羊IgG(1∶5 000)二抗進(jìn)行室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。目的蛋白條帶應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測，將每次實驗中的RAGE和PCNA的灰度值與內(nèi)參β-actin比較，使用Image Lab 3.0 軟件進(jìn)行半定量分析。

4.免疫組織化學(xué)：組織切片烤片、脫蠟、水化同前，將組織切片放入500 ml枸櫞酸鈉緩沖液中進(jìn)行高壓修復(fù)10 min；室溫下自然冷卻，PBS洗滌3次，每次5 min，3%H2O2室溫下濕盒孵育切片組織10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，封閉液(10%山羊血清)室溫濕盒孵育20 min，甩去封閉液，滴加PCNA抗體(1∶50)4℃濕盒孵育過夜，同時設(shè)立陰性對照組即使用PBS進(jìn)行孵育；次日37℃水浴箱復(fù)溫30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，使用兔二抗、山羊二抗室溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；DAB顯色液逐一鏡下顯色，待組織出現(xiàn)棕黃色后，甩去顯色液，蘇木素復(fù)染1 min，梯度酒精(75%、85%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ)脫水、二甲苯透明各5 min，封片后鏡下觀察切片顯色情況。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、AGE促進(jìn)原始卵泡向生長卵泡轉(zhuǎn)化

為了觀察AGE對原始卵泡激活的影響，本實驗取每組各10張培養(yǎng)后的卵巢切片，分別代表每組10個不同的卵巢，通過HE染色，分別計數(shù)各組原始卵泡和生長卵泡及其占總卵泡數(shù)的比例。我們發(fā)現(xiàn)在空白對照組和溶劑對照組培養(yǎng)的卵巢在原始卵泡構(gòu)成比和生長卵泡構(gòu)成比中均無顯著差異(F=2.898，P0.05)(表1)，說明較基礎(chǔ)培養(yǎng)液而言，BSA不影響卵巢卵泡的發(fā)育。而在AGE-BSA組中，生長卵泡構(gòu)成比顯著高于溶劑對照組，而原始卵泡構(gòu)成比則顯著低于溶劑對照組(F=2.776，P<0.001)(表1)。觀察HE染色圖我們發(fā)現(xiàn)，在AGE-BSA組卵巢最大橫截面切片中，卵巢髓質(zhì)部出現(xiàn)大量形態(tài)表現(xiàn)為原始卵泡的卵泡(圖1)。

表1 各實驗組的卵泡計數(shù)及卵泡構(gòu)成比(-±s)

注：每組10個卵巢；與其他兩組比較，*P<0.001

A：空白對照組；B：溶劑對照組；C：AGE-BSA組。圖中黑色箭頭示原始卵泡，紅色箭頭示初級卵泡，綠色箭頭示次級卵泡。標(biāo)尺為50 μm圖1 不同處理組中卵巢卵泡的形態(tài)表現(xiàn)(HE染色，×200)

二、AGE促進(jìn)PCNA表達(dá)

為了進(jìn)一步明確原始卵泡的生長情況，我們檢測了卵泡增殖相關(guān)指標(biāo)PCNA的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCNA在AGE處理組中的表達(dá)量顯著增加(F=6.72，P<0.05)(圖2，圖3A)。同時PCNA在空白對照組和溶劑對照組中表達(dá)無顯著差異(F=4.54，P0.05)(圖2，圖3A)。免疫組織化學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)在各級卵泡的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中(圖4)。

圖2 Western Blot檢測各實驗組中RAGE、PCNA的蛋白表達(dá)

三、AGE促進(jìn)受體RAGE的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗證AGE對原始卵泡生長的作用，我們用免疫蛋白印跡法半定量檢測各實驗組內(nèi)AGE受體RAGE的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與溶劑對照組相比，RAGE在藥物處理(AGE-BSA)組中的表達(dá)顯著增加(F=3.24，P<0.001)，說明AGE可能是通過AGE-RAGE軸引起卵巢內(nèi)卵泡的變化；RAGE在空白對照組和溶劑對照組中表達(dá)無顯著差異(F=3.23，P0.05)(圖2，圖3B)。

A：PCNA蛋白相對含量；B：RAGE蛋白相對含量；與溶劑對照組比較，*P<0.05，#P<0.001圖3 各實驗組PCNA、RAGE蛋白的相對含量

左側(cè)為3組的低倍視野圖像(×200)，右側(cè)為左側(cè)方框區(qū)域的高倍視野(×400)；圖中黑色箭頭所指的棕黃色部分為PCNA陽性表達(dá)部位。標(biāo)尺為50 μm圖4 PCNA在各實驗組中的定位表達(dá)(免疫組織化學(xué)SP染色)

討 論

近年來，由于生育年齡的普遍推遲以及一些醫(yī)源性因素(如手術(shù)機械性損傷、腫瘤術(shù)后放化療)導(dǎo)致的卵巢衰老所引起的女性不孕等問題被大家廣泛關(guān)注。在卵巢衰老過程中，原始卵泡作為卵巢內(nèi)數(shù)量最多的卵泡，其過早激活將直接導(dǎo)致卵泡池的提前耗竭，從而引起卵巢衰老的發(fā)生。另外，相關(guān)研究表明隨著AGEs在卵巢內(nèi)的增齡性積累，AGEs與原始卵泡的激活具有相關(guān)性。多項研究發(fā)現(xiàn)AGEs可以通過干擾卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt信號通路，導(dǎo)致多囊卵巢綜合征(PCOS)患者胰島素抵抗和無排卵的發(fā)生[10-11]。而在化療藥物對卵巢衰老作用機制的研究中發(fā)現(xiàn)順鉑能通過激活PTEN/Akt/FOXO3信號通路，增加生長卵泡池，促進(jìn)卵巢衰老的發(fā)生[12]。另外，大量研究表明，細(xì)胞內(nèi)AGEs-RAGE信號通路是AGEs介導(dǎo)產(chǎn)生一系列病理反應(yīng)的主要機制[13-14]。由此推測，AGE在與其受體RAGE結(jié)合后，可能通過以Akt分子為中心的信號通路激活原始卵泡，加速卵巢衰老發(fā)生。

為了驗證上述猜想，本實驗通過體外添加AGE-BSA制劑培養(yǎng)卵巢。研究發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢內(nèi)原始卵泡的形成開始于出生前2 d左右，持續(xù)至出生后3～4 d[15]。由此，我們選取4日齡小鼠為研究對象。基于本課題組前期研究已經(jīng)證明200 μg/ml AGE-BSA能明顯促進(jìn)休眠期原始卵泡的激活，我們有了以下發(fā)現(xiàn)：經(jīng)AGE-BSA處理后，生長卵泡占總卵泡數(shù)的比例顯著增加，同時伴隨著卵巢髓質(zhì)部原始卵泡的出現(xiàn)。結(jié)合Hirshfield[4]提出的原始細(xì)胞二分類理論，我們猜測AGEs可能在激活皮質(zhì)部原始卵泡生長的同時激活了卵巢髓質(zhì)部的原始卵泡，以此耗竭卵泡池。為了進(jìn)一步驗證以上實驗結(jié)果，我們選取了卵泡計數(shù)更為靈敏的指標(biāo)——細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)。PCNA被發(fā)現(xiàn)存在于多種哺乳動物的卵巢內(nèi)。研究表明大鼠卵巢PCNA的表達(dá)與顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞生長同步，因此，PCNA陽性表達(dá)可作為卵泡生長的標(biāo)志[16]。Picut等[17]發(fā)現(xiàn)PCNA表達(dá)在卵巢各級卵泡的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞內(nèi)，本實驗結(jié)果與之一致。免疫印跡法結(jié)果表明PCNA在AGE組中高表達(dá)，這與卵泡計數(shù)中總卵泡數(shù)增加的結(jié)果一致。另外，有研究發(fā)現(xiàn)PCNA開始表達(dá)于DNA合成的G1晚期，S期達(dá)高峰，之后逐漸下降[18]。由此我們猜測AGEs可以使卵泡中卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，從而導(dǎo)致其蛋白高表達(dá)。

AGEs受體有很多，RAGE作為其高親和性受體，主要分布于外周血單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)、血管內(nèi)皮等，在正常女性卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡內(nèi)膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞亦有表達(dá)[19]。研究表明，隨著年齡的增大，顆粒細(xì)胞RAGE的表達(dá)也隨之上升[20]。本實驗中，AGE處理后RAGE的蛋白表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步支持了AGE促進(jìn)原始卵泡激活的實驗結(jié)果。

綜上，我們認(rèn)為一定濃度的AGEs可能是通過促進(jìn)卵巢髓質(zhì)部原始卵泡的激活，耗竭卵泡池，最終引起卵巢衰老的發(fā)生。接下來，我們將進(jìn)一步研究AGEs促進(jìn)原始卵泡激活的分子作用機制，通過緩解原始卵泡池的消耗速度，盡可能地減緩女性由于年齡增加引起的卵巢儲備功能下降的發(fā)生，為治療由卵巢衰老引起的女性不孕等疾病提供新的思路。

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