李小東，高大禹，田慶貞，蔡叢菊，夏海鋒*，陳建新*

1(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江蘇泰州梅蘭春酒廠有限公司，江蘇 泰州，225300)

堆積發(fā)酵作為芝麻香型白酒實(shí)際生產(chǎn)過程中不可或缺的工藝環(huán)節(jié)，其成功與否將直接影響入窖發(fā)酵的進(jìn)行，最終影響出酒率和產(chǎn)酒質(zhì)量[1]。在堆積發(fā)酵過程中，酒醅網(wǎng)羅空氣環(huán)境以及生產(chǎn)器具的微生物，利用酒醅中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長、繁殖、代謝、產(chǎn)熱[2]。在堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)，發(fā)酵微生物獲得大量富集、酶動力大量積累、微生物代謝合成白酒基本風(fēng)味物質(zhì)以及芝麻香風(fēng)味成分的前體物質(zhì)[3]。

堆積發(fā)酵在開放式環(huán)境下進(jìn)行，受水分、空氣微生物、溫度以及氧氣濃度等因素的影響[4]。在堆積發(fā)酵前期，空氣流通、溫度適宜、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，各種微生物快速增殖，尤其是酵母菌和霉菌[5]。同時(shí)堆積發(fā)酵后期的高溫環(huán)境、不同部位酒醅氧氣濃度的差異、微生物之間的相互作用，使得各種微生物進(jìn)一步自然篩選，于堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)優(yōu)勢微生物菌群演替完成，為入窖發(fā)酵提供微生物基礎(chǔ)[6-7]。入窖發(fā)酵作為堆積發(fā)酵的延續(xù)和豐富，伴隨著窖內(nèi)微生物菌群進(jìn)一步演替以及微生物的代謝活動，最終賦予白酒特殊的芝麻香風(fēng)味[8]。而影響窖內(nèi)微生物菌群演替及其代謝活動的最主要因素為入窖初始微生物菌群的構(gòu)成[9]。此外，萬清徽等[10]通過將實(shí)際生產(chǎn)中堆積結(jié)束時(shí)的表層醅和中心醅按不同比例混合后進(jìn)行對比發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)不同混合比例酒醅會產(chǎn)生不同的發(fā)酵過程軌跡，最終影響原酒的香氣品質(zhì)。因此本文通過模擬實(shí)際堆積及入窖發(fā)酵過程，研究在不同堆積溫度條件下，不同的微生物菌群演替結(jié)果(即入窖初始微生物菌群構(gòu)成)對入窖發(fā)酵過程以及原酒品質(zhì)的影響，為芝麻香型白酒發(fā)酵過程控制及優(yōu)化技術(shù)提供實(shí)踐與理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)室堆積發(fā)酵所用的高粱、小麥、麩皮、高溫曲、中溫曲，麩曲均取至江蘇泰州梅蘭春酒廠。乙酸、乳酸(色譜純)阿拉丁；青霉素、制霉菌素，生工生物工程(上海)股份有限公司；葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸等試劑(分析純)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀(1260 infinity)，Agilent；氣相色譜儀(GC-2010 Plus)，日本SHIMADZU公司；生化培養(yǎng)箱(BSP-250)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；無紙記錄儀(SIN-R200D)，溫度探頭(Ptl00)，杭州聯(lián)測自動化技術(shù)有限公司；離心機(jī)(Pico 17)，Thermo。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)室模擬實(shí)際堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵

在實(shí)驗(yàn)室通過程序升溫培養(yǎng)箱進(jìn)行堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵。堆積發(fā)酵周期為48 h，入窖發(fā)酵周期為30 d，其中堆積發(fā)酵期間隔12 h取樣，入窖發(fā)酵前10 d，隔2 d取樣，后20 d隔4 d取樣測定指標(biāo)。堆積發(fā)酵模擬兩條溫度曲線，曲線1為酒廠夏季堆積溫度曲線，堆積頂溫達(dá)50.5 ℃，為高溫堆積。曲線2為酒廠冬季堆積溫度曲線，堆積頂溫達(dá)45.4 ℃，為低溫堆積。樣品1、2模擬溫度曲線1進(jìn)行高溫堆積，其中樣品1監(jiān)測中心部位酒醅溫度，樣品2監(jiān)測表層部位酒醅溫度。樣品3、4模擬溫度曲線2進(jìn)行低溫堆積，其中樣品3監(jiān)測中心部位酒醅溫度，樣品4監(jiān)測表層部位酒醅溫度。堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)，樣品1、3混勻后入窖發(fā)酵，而樣品2、4單獨(dú)取表層酒醅入窖發(fā)酵[10]。各樣品入窖發(fā)酵模擬1條溫度曲線(酒廠夏季窖池發(fā)酵溫度曲線)，發(fā)酵頂溫為41.5 ℃。堆積發(fā)酵過程中，樣品1、3均勻取樣，樣品2、4在表層部位取樣，入窖發(fā)酵過程中4個(gè)樣品均勻取樣測定指標(biāo)。堆積，入窖發(fā)酵期間使用無紙記錄儀實(shí)時(shí)監(jiān)測酒醅溫度變化。

1.3.2 酒醅微生物數(shù)量變化測定

稱取酒醅樣品10 g于90 mL無菌生理鹽水中混勻，使酒醅微生物充分洗脫于溶液中，并進(jìn)行梯度稀釋涂布于固體營養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌落長出并計(jì)數(shù)。其中酵母菌涂布于YPD固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L青霉素)，30 ℃培養(yǎng)2 d即可計(jì)數(shù)[11]。細(xì)菌涂布于LB固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培養(yǎng)1 d即可計(jì)數(shù)[11]。霉菌涂布于PDA固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L青霉素)，30 ℃培養(yǎng)4～5 d即可計(jì)數(shù)[11]。乳酸菌涂布于MRS固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培養(yǎng)2～3 d即可計(jì)數(shù)[12]。芽孢桿菌涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(添加100 mg/L制霉菌素)，37 ℃培養(yǎng)1 d即可計(jì)數(shù)。涂布之前需將酒醅菌液放置于恒溫水浴槽中，80 ℃處理20 min，殺死其余非芽孢微生物，再進(jìn)行稀釋涂布平板培養(yǎng)[13]。

1.3.3 酒醅理化指標(biāo)測定

酒醅樣品還原糖、酸度、淀粉以及淀粉出酒率的測定采用白酒發(fā)酵酒醅分析方法[14-15]。酒精度采用GC測定[16]，乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=152 551.08x+2 765.12，R2=0.994。

1.3.4 酒醅乳酸和乙酸含量測定

采用HPLC法測定[17]。乳酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y(mg/g酒醅)=2 134.84x+160.84，R2=0.999；乙酸標(biāo)準(zhǔn)曲線：y(mg/g酒醅)=2 704.36x+25.60，R2=0.999。

1.3.5 酒樣感官品評分析

最終酒樣采用暗杯盲評的方法進(jìn)行[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中溫度變化分析

如圖1所示，按方法1.3.1模擬實(shí)際堆積及入窖發(fā)酵過程且均達(dá)到預(yù)計(jì)期望。各樣品堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵酒醅實(shí)際溫度與設(shè)定溫度基本一致。其中在堆積發(fā)酵24 h以后，樣品2酒醅溫度略高于樣品1酒醅溫度，同樣樣品4酒醅溫度也略高于樣品3酒醅溫度?？赡苁怯捎跇悠?、4監(jiān)測表層部位酒醅溫度，樣1、3監(jiān)測中心部位酒醅溫度，而表層部位酒醅直接與空氣接觸，氧氣充足，微生物生長繁殖，代謝產(chǎn)熱更為劇烈，使得酒醅溫度也偏高。

A-堆積發(fā)酵溫度變化曲線；B-入窖發(fā)酵溫度變化曲線圖1 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵溫度變化曲線Fig.1 Temperature variation curve of accumulation and cellar fermentation

2.2 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中微生物數(shù)量變化分析

如圖2所示，在堆積發(fā)酵前24 h各樣品微生物增長較緩慢，但堆積36 h時(shí)，已達(dá)到堆積頂溫，表面開始出現(xiàn)“白霜”層酒醅[18]，此時(shí)酵母菌和霉菌增長最為顯著，均高于9.20 lgCFU/g。之后由于高溫環(huán)境，霉菌和酵母菌增長速率明顯變緩慢。此外總細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌數(shù)量也在不斷增加，但增加趨勢較平緩。

如表1所示，樣品1、3由于堆積溫度相差5 ℃，使得入窖初始微生物數(shù)量也存在差異。其中樣品1酵母菌、芽孢桿菌數(shù)量明顯高于樣品3，霉菌、總細(xì)菌和乳酸菌數(shù)量與樣品3較接近。樣品2、4由于是表層酒醅，在整個(gè)堆積發(fā)酵過程中，氧氣充足，各種微生物大量生長繁殖，其中酵母菌、霉菌數(shù)量與樣品1、3相比存在顯著差異，均高于9.04 lgCFU/g。另外總細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸菌數(shù)量也高于樣品1、3。因此在不同的堆積溫度條件下，微生物菌群演替過程以及入窖起始微生物數(shù)量均存在差異，且充足的氧氣可促進(jìn)微生物的增殖。

表1 入窖發(fā)酵第0天酒醅微生物數(shù)量比較Table 1 Comparison of microbial quantity of cellar fermentation on day 0

如圖2所示，酵母菌和霉菌從入窖發(fā)酵開始就處于下降趨勢，而且霉菌(好氧)下降速度高于酵母菌(兼性厭氧)。其中樣品1、3至發(fā)酵結(jié)束時(shí)酵母菌和霉菌僅剩2 lgCFU/g，而總細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸菌數(shù)量始終較高，但變化趨勢較平緩。樣品2、4盡管起始微生物數(shù)量遠(yuǎn)高于樣品1、3，但入窖發(fā)酵后，酵母菌下降速度與幅度均高于樣品1、3，尤其是樣品2中酵母菌下降速度基本與霉菌一致。兩樣品在發(fā)酵22 d后酵母菌已經(jīng)未能檢測到，霉菌至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為2 lgCFU/g。相反樣品2、4中細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌數(shù)量始終高于樣品1、3。因此入窖起始微生物數(shù)量的差異，直接影響各種微生物在后期發(fā)酵過程中的演替，進(jìn)而影響各種微生物的代謝活動。

A-樣品1微生物數(shù)量變化；B-樣品2微生物數(shù)量變化；C-樣品3微生物數(shù)量變化；D-樣品4微生物數(shù)量變化圖2 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵微生物數(shù)量變化Fig.2 Microbial quantity change of accumulation and cellar fermentation

2.3 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中酒醅理化指標(biāo)變化分析

如圖3所示，在堆積發(fā)酵前期，由于酒醅中微生物處于穩(wěn)定期，其生長繁殖，代謝活動較和緩，因此淀粉消耗緩慢，酒醅中還原糖變化處于緩升或平緩趨勢，另外酒精度變化也不明顯。在堆積發(fā)酵后期，由于酒醅中微生物急劇生長繁殖，代謝產(chǎn)熱，使得淀粉、還原糖迅速下降。另外酒醅中酵母菌大量增殖，酒精度也明顯升高。由于整個(gè)堆積發(fā)酵過程為好氧發(fā)酵，使得酒醅酸度處于緩慢下降趨勢。因此堆積發(fā)酵過程主要為微生物的富集以及相關(guān)代謝產(chǎn)物的積累，酒精發(fā)酵較微弱。

A-酒醅淀粉含量變化；B-酒醅還原糖含量變化；C-酒醅酸度變化；D-酒醅酒精度含量變化圖3 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中理化指標(biāo)變化Fig.3 Physical and chemical indexes change of accumulation and cellar fermentation process

如圖3-D所示，樣品1、3在入窖發(fā)酵前10 d，主要為酵母菌利用還原糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，產(chǎn)大量的酒精，這與曹維超等人研究結(jié)果類似[19]。同時(shí)氧氣的消耗、酒醅溫度和酒精濃度的升高也抑制酵母菌的生長，代謝[20]，因此發(fā)酵至第10天時(shí)酵母菌數(shù)量下降至5 lgCFU/g，同時(shí)酒精體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3.2%～3.5%。在此期間由于酒精發(fā)酵的劇烈進(jìn)行，酒醅中淀粉下降迅速，還原糖也迅速被消耗，之后還原糖雖然平緩回升，但仍然處于較低濃度。此外細(xì)菌，芽孢桿菌，乳酸菌在此期間生長繁殖，代謝產(chǎn)酸均被抑制，因此在數(shù)量上變化平緩，且酒醅酸度也平緩上升。在發(fā)酵后期，由于酒精發(fā)酵幾乎停止，微生物代謝活動較弱，因此還原糖回升較快，淀粉也平緩下降，直到發(fā)酵結(jié)束。此外樣品3在發(fā)酵22 d之后，酸度上升明顯，還原糖也有所下降，可能是由于樣品3中總細(xì)菌、乳酸菌數(shù)量有所增加(圖2-C)，代謝產(chǎn)酸造成的。由此可見在堆積發(fā)酵過程中控制適宜的微生物菌群數(shù)量可以保證入窖后酒精發(fā)酵的正常進(jìn)行。

如圖3所示，與樣品1、3相比，樣品2、4在入窖后除淀粉消耗相似之外，還原糖、酸度、酒精度變化均存在明顯差異。雖然樣品2、4起始微生物數(shù)量有明顯優(yōu)勢，但在入窖發(fā)酵前期，酵母菌數(shù)量下降迅速，酒精發(fā)酵被嚴(yán)重抑制，酒精度遠(yuǎn)低于樣品1、3(圖3-D)。尤其是樣品2在整個(gè)發(fā)酵過程中酒精發(fā)酵異常微弱，同時(shí)也正因?yàn)榫凭l(fā)酵被抑制，其還原糖回升也快。因此樣品2、4在發(fā)酵結(jié)束時(shí)出酒率遠(yuǎn)低于樣品1、3，尤其是樣品2的出酒率僅達(dá)8.23%(表2)。

表2 不同樣品流酒量和淀粉出酒率差異比較Table 2 Comparison of liquor quantity and starch liquoryield among different samples

注：樣品5為酒廠實(shí)際發(fā)酵酒醅并于實(shí)驗(yàn)室蒸餾。

推測可能是由于兩樣品中總細(xì)菌、芽孢桿菌和乳酸菌起始數(shù)量過高，代謝產(chǎn)酸，酒醅升酸快(圖3-C)，酵母菌酒精發(fā)酵被抑制，導(dǎo)致發(fā)酵異常。因此入窖起始微生物菌群數(shù)量過高，入窖后各種微生物之間相互競爭，抑制作用激烈，并不利于微生物正常演替以及酒精發(fā)酵，甚至導(dǎo)致發(fā)酵異常。

2.4 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中乳酸和乙酸變化分析

如圖4所示，在堆積發(fā)酵過程中，酒醅中乳酸呈下降趨勢。而在堆積發(fā)酵后期，酒醅中酵母菌大量生長繁殖，代謝產(chǎn)乙醇，加上高溫、氧氣充足的堆積環(huán)境，乙醇被氧化成乙酸[21]，使得各樣品中乙酸量緩慢上升。此外樣品1、3和樣品2、4由于取樣位置不同，導(dǎo)致乙酸和乳酸量也存在差異。

A-酒醅乳酸含量變化；B-酒醅乙酸含量變化圖4 堆積發(fā)酵和入窖發(fā)酵過程中乳酸和乙酸變化Fig.4 Lactic acid and acetic acid change of accumulation and cellar fermentation process

在入窖發(fā)酵前10 d，樣品1、3中乳酸和乙酸量變化平緩，且均處于較低濃度。在此期間，樣品1、3酒精發(fā)酵也正常進(jìn)行，酒精體積分?jǐn)?shù)迅速上升達(dá)到3.2%～3.5%(圖3-D)。此外，樣品3在發(fā)酵22 d以后可能是由于總細(xì)菌、乳酸菌數(shù)量增加，代謝產(chǎn)酸，使得乳酸和乙酸呈上升趨勢。樣品2、4在入窖發(fā)酵前兩天乳酸量迅速上升，之后發(fā)酵至第10天乳酸量雖然變化平緩，但濃度仍高于樣品1、3。另外樣品2、4中乙酸量卻在不斷增加，濃度顯著高于樣品1、3，尤其是樣品2在發(fā)酵第10天時(shí)乙酸量達(dá)3.45 mg/g酒醅。但在此期間樣品2、4中的酵母菌數(shù)量迅速下降，酒精發(fā)酵被嚴(yán)重抑制，其中樣品4酒精度上升緩慢且遠(yuǎn)低于樣品1、3，而樣品2在發(fā)酵2 d以后，酒精發(fā)酵幾乎停止，酒精體積分?jǐn)?shù)最低且基本未發(fā)生變化(圖3-D)。最終導(dǎo)致樣品2出酒率最低，其次是樣品4，遠(yuǎn)低于樣品1、3出酒率(表2)。因此導(dǎo)致樣品2、4發(fā)酵異常的原因可能是起始微生物菌群數(shù)量過高，代謝產(chǎn)乙酸抑制酵母菌酒精發(fā)酵[22-23]。

2.5 不同酒樣感官品評差異分析

如表3所示，樣品1和樣品3之間的差異主要存在于酒體風(fēng)格。樣品1由于堆積溫度高(頂溫達(dá)50.9 ℃)，且芽孢桿菌數(shù)量豐富，更有利于風(fēng)味物質(zhì)的合成，使得酒樣焦糊香突出，呈現(xiàn)醬香的同時(shí)兼有芝麻香，與酒廠夏季發(fā)酵酒樣接近，屬于芝麻香型白酒中典型的“醬芝”風(fēng)格。而樣品3由于堆積溫度低(頂溫達(dá)45.7 ℃)，堆積發(fā)酵劇烈程度低于樣品1，因此酒樣焦糊香弱，芝麻香突出，與酒廠冬季發(fā)酵酒樣接近，屬于芝麻香型白酒中典型的“清雅芝麻香”風(fēng)格。樣品2、4在發(fā)酵過程中升酸過快，尤其是乙酸量迅速增加，酵母菌酒精發(fā)酵未能正常進(jìn)行，酒樣呈現(xiàn)尖酸、異味，入口酸澀味重，為發(fā)酵異常。因此在不同的堆積溫度條件下，堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)微生物菌群構(gòu)成不同，最終影響原酒的質(zhì)量和酒體風(fēng)格。

表3 不同酒樣感官品評和酒體風(fēng)格Table 3 Sensory evaluation and liquor style of different liquor samples

注：樣品5為酒廠實(shí)際發(fā)酵酒醅并于實(shí)驗(yàn)室蒸餾。

3 結(jié)論

堆積發(fā)酵作為芝麻香型白酒生產(chǎn)過程中最為關(guān)鍵的工藝環(huán)節(jié)，通過堆積發(fā)酵，酒醅中酵母菌、霉菌、總細(xì)菌、芽孢桿菌、乳酸菌得到大量富集與篩選，在數(shù)量上達(dá)8.16～9.35 lgCFU/g，為入窖發(fā)酵提供微生物基礎(chǔ)。

在不同堆積發(fā)酵溫度條件下，入窖發(fā)酵初始微生物菌群數(shù)量不同，其中霉菌、總細(xì)菌、乳酸菌數(shù)量較接近，而酵母菌和芽孢桿菌數(shù)量差異明顯。入窖后在厭氧以及特定發(fā)酵溫度條件下，伴隨著微生物菌群進(jìn)一步演替并進(jìn)行相關(guān)代謝活動，最終出酒率正常，原酒質(zhì)量合格，但酒體風(fēng)格不同。其中高溫堆積條件下出酒率稍微偏低，但利于生香，酒樣呈現(xiàn)醬香的同時(shí)兼有芝麻香，為“醬芝”風(fēng)格。而低溫堆積條件下利于產(chǎn)酒，酒樣芝麻香突出，為“清雅芝麻香”風(fēng)格。在堆積發(fā)酵結(jié)束時(shí)，表層酒醅中各種微生物數(shù)量處于絕對優(yōu)勢，其中酵母菌、霉菌、總細(xì)菌數(shù)量達(dá)9.04～9.35 lgCFU/g。單獨(dú)取表層酒醅入窖后，酒醅升酸快，尤其是乙酸量迅速增加，酵母菌下降迅速，最終出酒率低，原酒質(zhì)量不合格。可能是由于入窖初始微生物菌群數(shù)量過高，入窖后微生物之間相互競爭、抑制作用激烈，最終細(xì)菌成為整個(gè)發(fā)酵過程的優(yōu)勢菌群，代謝產(chǎn)乙酸抑制酵母菌酒精發(fā)酵。因此在堆積發(fā)酵過程中控制適宜的微生物種類和數(shù)量對入窖發(fā)酵過程、原酒質(zhì)量以及酒體風(fēng)格有重要影響。

由于堆積發(fā)酵的開放環(huán)境，如何更加穩(wěn)定，有效地調(diào)控堆積發(fā)酵過程，為入窖發(fā)酵提供更為合適的微生物基礎(chǔ)以及代謝產(chǎn)物基礎(chǔ)，需要更加深入研究微生物之間的相互作用機(jī)理以及其他環(huán)境因素對堆積發(fā)酵的影響。

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