張黎麗 劉 博 王浩宇 常允康

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，日照 276826)

海洋微生物種類(lèi)豐富，參與海洋生態(tài)循環(huán)，與海洋環(huán)境有著密切聯(lián)系，對(duì)維護(hù)海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定起重要作用[1]。近岸海域由于其有機(jī)物含量較高，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。Williams等[2]從近岸海域分離得到的藍(lán)細(xì)菌和放線菌所分泌的大量化合物具有治療腫瘤和傳染病的作用，可作為寶貴的藥物來(lái)源；信艷娟等[3]從大連灣原油污染海域分離得到高效的石油烴降解菌，可用于海洋石油污染的降解，具有良好的應(yīng)用前景。因此，研究近岸海域的微生物群落，能更全面地了解相關(guān)海域的微生物分布情況和生態(tài)意義，有助于發(fā)現(xiàn)和利用微生物資源。

目前，針對(duì)日照近岸海域的微生物群落結(jié)構(gòu)研究較少。本文通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)的方法對(duì)該海域微生物的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，以了解和認(rèn)識(shí)該海域微生物的主要分類(lèi)及作用，為合理開(kāi)發(fā)利用海洋微生物資源提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用海水取自日照近岸海域3個(gè)取樣點(diǎn)(圖1)，基本沿海岸線均勻分布，每個(gè)取樣點(diǎn)周邊取樣3次。

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，SOB培養(yǎng)基，SOC培養(yǎng)基(在SOB培養(yǎng)基中添加10ml滅菌的1mol/L葡萄糖)。

圖1 取樣點(diǎn)分布示意圖

主要試劑：水樣DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories，Inc.，USA)，TAE緩沖液(北京索萊寶科技有限公司)，大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞(北京索萊寶科技有限公司)，X-Gal(北京索萊寶科技有限公司)，IPTG(北京索萊寶科技有限公司)，凝膠回收試劑盒(寶生物工程有限公司)，TA克隆載體pMD-19T(寶生物工程有限公司)，限制性?xún)?nèi)切酶MspⅠ(寶生物工程有限公司)。

主要儀器：PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)熱電公司)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱(南通海倫生物器材制造有限公司)，超凈工作臺(tái)(北京華威興業(yè)科技有限公司)，凝膠成像儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)，核酸電泳儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)。

1.2 方法

1.2.1海水總DNA提取 將海水樣品進(jìn)行等體積混合均勻后，用一次性滅菌的注射器將100ml樣品用0.22μm濾膜過(guò)濾，將其中的微生物截留到濾膜表面及濾孔中。用鑷子取下濾膜，參照水樣DNA提取試劑盒的操作步驟提取樣品中的總DNA。提取的總DNA用1%瓊脂糖凝膠、100V電壓進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.2海水DNA擴(kuò)增及產(chǎn)物純化 以提取的總DNA為模板，采用細(xì)菌16S通用引物27F(AGRGTTTGATCMTGGCTCAG)和1387R(GGGCGGWGTGTACAAGGC)進(jìn)行擴(kuò)增(反應(yīng)體系見(jiàn)表1)。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3min，95 ℃變性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸1.5min，循環(huán)28次，然后72 ℃終延伸7min。擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠、100V電壓進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 海水DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系

為了防止擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增而影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，需對(duì)目的條帶進(jìn)行回收、純化，參照凝膠回收試劑盒的操作步驟進(jìn)行。純化后的產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠、100V電壓進(jìn)行電泳檢測(cè)，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物是否純化成功。

1.2.3陽(yáng)性克隆篩選 將擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體pMD19-T連接，體系為pMD19-T Vector 1μl，PCR產(chǎn)物4μl，Solution I溶液 5μl，4 ℃連接過(guò)夜。將過(guò)夜連接的產(chǎn)物加入到100μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30min。從SOC培養(yǎng)基中取890μl加入到激活的感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃、180 rpm搖床培育1h。分別取50μl、100μl、300μl、500μl培養(yǎng)液涂布于含有8μl IPTG、40μl X-Gal、含0.1%氨芐的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)后的平板放入4 ℃冰箱中顯色1h，從長(zhǎng)滿(mǎn)克隆的平板上隨機(jī)挑選64個(gè)白色克隆劃線至含0.1%氨芐的平板上，37 ℃培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出。每個(gè)克隆分別進(jìn)行菌落DNA擴(kuò)增(反應(yīng)體系見(jiàn)表2)，所用載體引物為M13-47(CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC)和RV-M(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3min，95 ℃變性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸1.5min，循環(huán)28次，72 ℃終延伸7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠、100V電壓進(jìn)行電泳檢測(cè)假陽(yáng)性克隆。

菌落DNA模板制作的方法為：挑克隆到10μl無(wú)菌水中，95 ℃水浴10min，冰上放置3min，5000rpm離心2min，取上清即為模板。

表2 菌落DNA擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.2.4酶切分型 用限制性?xún)?nèi)切酶MspI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，體系為：10×Buffer 0.8ml，MspⅠ 0.4μl，擴(kuò)增產(chǎn)物3.6μl，補(bǔ)無(wú)菌水至8μl，37 ℃消化16h后，用3%瓊脂糖凝膠、65V電泳約1h后進(jìn)行檢測(cè)。酶切后產(chǎn)物的電泳圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性，對(duì)電泳圖譜進(jìn)行歸類(lèi)分析，圖譜一致視為同種克隆。

1.2.5目的基因測(cè)序 分別從同種克隆里選出一個(gè)接種于含0.1%氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200rpm搖床中培養(yǎng)8h后，取2ml菌液，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.6測(cè)序結(jié)果分析 將所測(cè)得的序列提交至NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果分析微生物的群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 海水總DNA提取

海水樣品中的總DNA提取結(jié)果如圖2所示，編號(hào)為1的條帶為提取的總DNA，可見(jiàn)明顯條帶，能夠滿(mǎn)足后續(xù)分析需要。

圖2 海水樣品總DNA

2.2 海水DNA擴(kuò)增及產(chǎn)物純化

擴(kuò)增產(chǎn)物如圖3中條帶1所示，可見(jiàn)條帶較亮，但存在輕微拖尾現(xiàn)象。

圖3 海水DNA擴(kuò)增產(chǎn)物

對(duì)目的條帶進(jìn)行回收、純化后結(jié)果如圖4條帶1所示?？梢?jiàn)單一條帶，無(wú)拖尾現(xiàn)象，純化效果好。

圖4 純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3 陽(yáng)性克隆篩選

由于T載體自連等原因，往往白色克隆中會(huì)有部分是假陽(yáng)性克隆。如圖5所示，共有15個(gè)假陽(yáng)性克隆(克隆編號(hào)分別為：13、15、16、27、31、33、34、37、40、41、46、57、58、62、64)。

圖5 假陽(yáng)性克隆電泳檢測(cè)

2.4 酶切分型

如圖6所示，酶切后產(chǎn)物的電泳圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性，將酶切帶型一致的克隆歸為一類(lèi)，定義為一個(gè)分類(lèi)單元，共分為15類(lèi)，從每一類(lèi)中任選1個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序(測(cè)序的克隆編號(hào)：2、3、4、12、18、19、20、24、28、30、36、39、42、48、56)。

圖6 限制性?xún)?nèi)切酶MspⅠ酶切圖譜

2.5 測(cè)序結(jié)果分析

將所測(cè)得的序列提交至NCBI進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 測(cè)序比對(duì)結(jié)果

對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，如圖7所示，日照近岸海域微生物群落組成來(lái)自4個(gè)門(mén)類(lèi)。其中，變形菌門(mén)(Proteobacteria)所占比例最高，達(dá)63%；擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)次之，達(dá)27%；浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)所占比例較低，分別為6%和4%。

圖7 門(mén)水平群落組成

如圖8所示，日照近岸海域微生物群落組成來(lái)自9個(gè)目類(lèi)。其中，紅細(xì)菌目(Rhodobacterales)、黃桿菌目(Flavobacteriales)、交替單胞菌目(Alteromonadales)所占比例較高，分別達(dá)到37%、27%和14%；其余6個(gè)目類(lèi)所占比例較低，均低于10%。

圖8 目水平群落組成

如圖9所示，日照近岸海域微生物群落組成來(lái)自十幾個(gè)不同屬類(lèi)。其中，亞硫酸桿菌屬(Sulfitobacter)所占比例最高，高達(dá)35%。海洋微生物作為生物活性物質(zhì)的來(lái)源越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的重視[4]。龍聰?shù)萚5]對(duì)44株來(lái)源于中國(guó)東海的亞硫酸桿菌進(jìn)行生物學(xué)活性分析。結(jié)果顯示，其表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒活性及抗氧化活性，具有潛在的藥用價(jià)值。Brakstad等[6]發(fā)現(xiàn)亞硫酸桿菌屬的細(xì)菌與海洋原油的生物降解密切相關(guān)。高慧[7]選取全國(guó)13個(gè)不同油污染的地區(qū)水樣研究發(fā)現(xiàn)，以柴油為唯一碳源，篩選出具有柴油降解能力的亞硫酸桿菌。另外，假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)和黃桿菌屬(Flavobacterium)所占比例也較高，分別達(dá)到15%和12%。假交替單胞菌能分泌多種胞外活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)在防治有害藻類(lèi)水華、生物防污、工業(yè)生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)抗菌和抗腫瘤海洋藥物等方面展示了誘人的應(yīng)用前景[8]。孫雪瑩[9]從300株細(xì)菌中篩選出一株既能夠產(chǎn)酶又拮抗?fàn)N爛弧菌的假交替單胞菌，且不產(chǎn)生溶血素，不具有潛在的致病性，可作為貝類(lèi)生長(zhǎng)的益生菌。姜肸等[10]從南海10個(gè)采樣點(diǎn)篩選出6株對(duì)石油烴有較強(qiáng)降解能力的細(xì)菌，其中有兩株為假交替單胞菌。許曉毅等[11]從長(zhǎng)江近岸表層沉積物中分離出2株能以菲和熒蒽為碳源和能源生長(zhǎng)的菌株，其中一株為黃桿菌屬，且表現(xiàn)出非常強(qiáng)的多環(huán)芳烴降解能力。

圖9 屬水平群落組成

3 結(jié)論

通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)對(duì)日照近岸海域的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示此海域微生物多樣性水平較高，主要包括亞硫酸桿菌屬、假交替單胞菌屬和黃桿菌屬等。其中，亞硫酸菌屬所占的比重最大，具有潛在的生態(tài)意義和藥用價(jià)值。另外，能夠降解石油烴的微生物比重較大，說(shuō)明日照近岸海域的石油烴污染可能性較大，究其原因可能是日照作為新興的港口城市，難免存在港口和船舶操作性含油污水的排放及油類(lèi)作業(yè)泄露。本研究可以更好地了解和認(rèn)識(shí)該海域微生物的主要分類(lèi)及作用，并以此為依據(jù)分析日照近岸海域特征及海洋狀況，達(dá)到合理開(kāi)發(fā)利用海洋資源的目的，促進(jìn)半島藍(lán)色經(jīng)濟(jì)區(qū)的可持續(xù)發(fā)展。

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