孫 芳 王紅紅 張 姣 郇 通 李 艷△

(1濟寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,濟寧 272067;2大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,大理 671000;3杭州市第一人民醫(yī)院， 杭州310006)

組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(nuclear receptor SET domain containing protein 2，NSD2)也作MMSET或者WHSC1，是NSD蛋白家族的成員之一，利用其含有的SET結(jié)構(gòu)域，主要催化組蛋白H3賴氨酸第36號位的二甲基化(H3K36me2)，進一步發(fā)揮基因調(diào)控作用[1]。NSD2與多種疾病尤其是腫瘤關(guān)系密切[2]。如：NSD2的過表達與前列腺癌、頭頸部鱗癌的高分級、腫瘤細胞增殖密切相關(guān)[3-4]，與肝細胞癌[5]、卵巢癌[6]、子宮內(nèi)膜癌[7]、子宮頸癌[8]的分期、分級以及不良預(yù)后密切相關(guān)，與骨肉瘤[9]細胞增殖、轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后密切相關(guān)等。另外，NSD2單倍體不足可以導(dǎo)致以腦部發(fā)育過小為特點的沃爾夫綜合征[10]，在神經(jīng)母細胞瘤中，NSD2高表達與腫瘤不良臨床病理特征聯(lián)系，與轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后密切相關(guān)[11]。目前NSD2的生理功能和致癌機制大部分仍不清楚，我們在體外誘導(dǎo)了小鼠胚胎干細胞(mESCs)向神經(jīng)細胞(NCs)方向分化，觀察NSD2和相關(guān)組蛋白修飾H3K36me2、H3K36me3在mESCs向NCs分化過程中的蛋白表達變化，旨在為進一步研究NSD2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的生理功能和作用機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 E14Tg2A.4小鼠胚胎干細胞由首都師范大學(xué)張偉偉教授實驗室贈送。

1.1.2試劑 DMEM培養(yǎng)基、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、核苷酸、β-巰基乙醇、青霉素-鏈霉素 、明膠、1000 U/ml白血病抑制因子(LIF)均為Millipore公司產(chǎn)品;胎牛血清(Hyclone公司)；維甲酸(RA,sigma公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Fermentas公司)；Taq酶(Roche公司)；β-actin一抗(60008-1,DATASHEET公司)；NSD2一抗(ab75359,abcam公司)；H3K36me2一抗(39891，Active Motif公司)；H3K36me3一抗(4909S，Cell Signaling公司)；H3(ab1791,abcam公司)；二抗(ab6709,abcam公司)。

1.1.3儀器 倒置顯微鏡(ZEISS公司)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；垂直電泳和轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；蛋白印跡檢測系統(tǒng)(ImageQuant LAS4000)。

1.2 方法

1.2.1維甲酸(RA)法誘導(dǎo)ESCs向NCs分化 mESCs用含有15%胎牛血清、各1%非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、核苷酸、青霉素-鏈霉素、1000U/ml LIF的DMEM完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，將細胞按照培養(yǎng)天數(shù)(D0～D5)分組，將D0細胞作為對照組，其他作為實驗組，收集細胞進行后續(xù)實驗。具體如下：當培養(yǎng)至細胞數(shù)18×106，收取3×106細胞，當作第0天(標記為D0，其中1/3細胞沉淀備用于RIPA裂解提取總蛋白做Western Blot,1/3備用于酸提取組蛋白做Western Blot，1/3備用于提RNA)。其余細胞按照1.5×106/10cm培養(yǎng)皿的密度種植到10個培養(yǎng)皿，用不加LIF的DMEM完全培養(yǎng)基,加入RA(濃度5×10-7mol/L)進行誘導(dǎo)，其間每天進行細胞換液,觀察細胞形態(tài)并拍照保存，于D5誘導(dǎo)結(jié)束。于誘導(dǎo)分化的D1～D5分別收集細胞2盤，同樣的，其中1/3細胞沉淀備用于提取總蛋白做Western Blot,1/3細胞沉淀備用于提取組蛋白做Western Blot，1/3備用于提RNA。

1.2.2RT-qPCR法檢測mESCs標記物、NCs早期分化標記物mRNA的表達 在細胞分化過程中，按固定時間收獲細胞，Trizol 試劑提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,進行Real-Time PCR。相應(yīng)小鼠引物設(shè)計如下(華大基因合成)。見表1。

表1 引物序列

1.2.3Western Blot檢測NSD2及相關(guān)組蛋白修飾的蛋白表達 總蛋白Western Blot分析NSD2表達：將收獲的細胞沉淀，每管加入100μl碧云天的強RIPA裂解液，冰上裂解30min，用Biosafer 1000細胞超聲破碎儀破碎細胞，4℃，16000r，離心10min，取上清，測定蛋白濃度，按照60μg的上樣量進行 SDS-PAGE蛋白電泳，4℃,360mA,60min轉(zhuǎn)膜，3%脫脂奶粉封閉1h,一抗β-actin (1∶10000)、NSD2(1∶3000)室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次5～10 min，二抗(1∶10000)室溫孵育1h，再用TBST洗膜3次，每次5～10 min，ECL化學(xué)發(fā)光，蛋白印跡檢測系統(tǒng)顯影，利用Image Quant TL軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參,計算相對蛋白含量。

組蛋白Western Blot分析H3K36me2、H3K36 me3的表達：采用酸提取法，即0.2N HCl 4℃過夜處理細胞沉淀，4℃,16000r,離心10min， 取上清，1/5體積的1M NaOH中和，測定蛋白濃度，按照20μg的上樣量進行 SDS-PAGE蛋白電泳，4℃,360mA,20min轉(zhuǎn)膜，3%脫脂奶粉封閉1h,一抗H3K36me2(1∶1000)、H3K36me3(1∶2000)室溫孵育1h，后續(xù)操作同上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件統(tǒng)計包進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)觀察

mESCs細胞呈圓或卵圓形，胞核相對比較大并且核仁比較明顯。加入RA誘導(dǎo)1天時(D1)，細胞增殖明顯，逐漸向外擴展，并且發(fā)生明顯的形狀改變，RA誘導(dǎo)3天時(D3)細胞開始伸出突起，變細變長，在誘導(dǎo)第5天(D5)時，細胞形態(tài)已趨于一致，胞體圓亮，多呈雙極性，逐漸連接成神經(jīng)樣網(wǎng)絡(luò)。見圖1。

注：A,mESCs ;B,誘導(dǎo)分化第1天;C,誘導(dǎo)分化第3天;D,誘導(dǎo)分化第5天

圖1 mESCs向NCs誘導(dǎo)分化過程中細胞形態(tài)的觀察(100×)

2.2 mESCs標記物、NCs早期分化標記物的mRNA表達情況

與初始胚胎干細胞狀態(tài)(D0)相比，在誘導(dǎo)分化結(jié)束時(D5)，干細胞標記物Sox2、Oct3/4、Nanong的mRNA水平顯著下降，NCs早期分化標記物Nestin、 NeuroD、 Tuj1的mRNA水平顯著上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖2。綜合細胞形態(tài)學(xué)上的變化和mRNA表達水平變化，可以基本確定體外mESCs經(jīng)RA誘導(dǎo)向NCs方向分化成功。

2.3 mESCs向NCs分化過程中NSD2蛋白表達量變化

通過Western Blot,本實驗檢測到I型NSD2(75kd)和II型NSD2(150kd)在mESCs向NCs分化過程中的蛋白特異性表達變化，II型NSD2因具備甲基轉(zhuǎn)移酶活性，所以更有意義。結(jié)果顯示：NSD2在mESCs狀態(tài)(D0)相對蛋白水平表達較低，在加入RA誘導(dǎo)向NCs分化1天后(D1)，突然升高，隨后在誘導(dǎo)分化的第2天(D2)開始下降,并于第3天(D3)開始直到觀察結(jié)束幾乎消失，即先升高后下降的變化，與D0相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見圖3。

A

B

注：與D0組比較，*P<0.05 ;

A，mESCs標記物在D0和D5時mRNA的表達;

B，NCs早期分化標記物在D0和D5時mRNA的表達

圖2 mESCs標記物和NCs早期分化標記物在D0和D5時mRNA的表達

A

B

注：與D0組比較，*P<0.05

圖3 NSD2在ESCs向NCs分化過程中蛋白表達量的變化

2.4 mESCs向NCs分化過程中NSD2相關(guān)組蛋白甲基化標記的表達變化

本實驗觀察了在mESCs向NCs分化過程中，NSD2直接催化的組蛋白標記H3K36me2的表達變化，NSD2表達量與H3K36me2變化趨勢不完全一致。以總體的組蛋白H3為內(nèi)參，H3K36me2的相對蛋白表達量未有顯著變化。另外，本實驗還觀察了以H3K36me2為底物的H3K36me3，其變化也不明顯?？偟膩碚f組蛋白甲基化總量變化較小,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 ESCs向NCs分化過程中NSD2相關(guān)組蛋白甲基化標記的表達變化

3 討論

作為表觀遺傳學(xué)研究的一個重要內(nèi)容，組蛋白修飾與疾病的關(guān)系越來越受到人們的重視，成為當前研究的一個熱點。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶NSD2與神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，然而，NSD2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的生理功能以及致癌機制大部分仍不清楚。本文在體外成功地誘導(dǎo)了ESCs 向NCs的分化，觀察NSD2及相關(guān)組蛋白修飾的蛋白表達變化，以期為下一步研究提供依據(jù)。

早就有研究表明NSD2單倍體不足可以導(dǎo)致沃爾夫綜合征(Wolf Hirschhorn syndrome),而NSD2缺陷的小鼠出生后死于心臟異常和類似于沃爾夫綜合征的表型[10]。沃爾夫綜合征兒童具有腦部生長過小和智力發(fā)育不全特點，即神經(jīng)細胞數(shù)量減少的情況,推測NSD2的一個生理功能是促進NCs增殖作用。同時，Hudlebusch等[11]研究表明，NSD2在神經(jīng)母細胞瘤中的表達水平是升高的，高表達的NSD2與患者預(yù)后差相關(guān)，并且高表達的NSD2是神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖所必需的，這與NSD2促進NCs增殖的作用是一致的。

本實驗采用RA誘導(dǎo)法，在體外成功的誘導(dǎo)了ESCs 向NCs的分化，觀察到NSD2在mESCs向NCs分化過程中特異性的蛋白表達變化，這與我們先前用擬胚體分化法誘導(dǎo)mESCs 向NCs的分化過程中觀察到的總體結(jié)果是一致的[12]。實驗中觀察到：RA作用的早期(D1)，細胞的增殖明顯，而后期(D2-D5)主要是向NCs的分化。我們將整個誘導(dǎo)分化過程分為三個階段，發(fā)現(xiàn)NSD2蛋白發(fā)生了特異性的表達變化，第一階段：即mESCs(D0)，NSD2蛋白水平比較低；第二階段：即在RA作用下細胞明顯增殖階段(D1),NSD2蛋白水平迅速升高，顯示出與細胞增殖速度的密切相關(guān)；第三階段：即在RA持續(xù)作用下，細胞停止增殖，開始向NCs方向持續(xù)分化階段(D2-D5)，NSD2蛋白水平是顯著下降的。由此，我們推測NSD2可能具有促進神經(jīng)細胞增殖，抑制細胞分化的作用，但值得進一步研究?？偟膩碚f，NSD2蛋白水平發(fā)生的顯著變化，可能提示NSD2在調(diào)控mESCs 向NCs發(fā)育中，具有重要的生理功能。在之前我們的另一個研究中，甲基化轉(zhuǎn)移酶EZH2,在mESCs 向NCs的分化過程中也呈現(xiàn)下降趨勢的蛋白表達變化，這或許提示了EZH2 和NSD2在調(diào)控NCs發(fā)育中，有一定功能上的協(xié)同性[13]，有研究也報道過EZH2 和NSD2可能通過microRNA存在著密切聯(lián)系[14]，下一步我們將通過沉默和轉(zhuǎn)染NSD2和EZH2,觀察其對神經(jīng)細胞發(fā)育的影響，深入研究NSD2和EZH2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的生理功能，并進一步研究NSD2和EZH2的相互作用機制。

NSD2主要通過催化H3K36me2進一步調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活，研究表明，在某些腫瘤比如在多發(fā)性骨髓瘤中，NSD2的過表達可以引起整個基因組的H3K36me2水平升高[15]，然而本實驗觀察到ESCs向NCs分化過程中NSD蛋白表達量的改變與其催化的組蛋白修飾H3K36me2變化趨勢不完全一致，組蛋白甲基化修飾總量的變化比較小，這可能是因為同時受到其他甲基化轉(zhuǎn)移酶與去甲基化酶綜合作用的結(jié)果，NSD2的變化不一定改變總體的H3K36me2水平,可能只是影響局部少量基因區(qū)。盡管如此，NSD2對局部關(guān)鍵基因的調(diào)控，可以引起基因的轉(zhuǎn)錄激活，仍具有重要意義。

綜上所述，本實驗在體外成功建立了mESCs向NCs分化體系，觀察到了與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)的組蛋白甲基化修飾酶NSD2以及相關(guān)的組蛋白修飾的表達變化，為下一步研究NSD2在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的生理功能和在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制打下了基礎(chǔ)。

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