石變?nèi)A，孫佳增，張 尚，史 娟

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

腎臟纖維化(renal fibrosis, RF)是慢性腎臟疾病終末期的主要病理改變，表現(xiàn)為正常腎單位被成纖維細(xì)胞及肌成纖維細(xì)胞代替，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)堆積等[1]。轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β, TGF-β)在腎臟纖維化發(fā)生中有關(guān)鍵作用[2]。microRNA(miRNA)是進(jìn)化保守的非編碼小分子RNA，可由細(xì)胞和組織釋放入循環(huán)系統(tǒng)[3]，可作為多種疾病和組織損傷生物標(biāo)志物。目前通過活體組織診斷腎臟纖維化，因此尋找簡便、準(zhǔn)確的生物標(biāo)志物對診斷與監(jiān)測腎間質(zhì)纖維化至關(guān)重要。

在前期研究中構(gòu)建了大鼠腎臟纖維化模型，利用第2代高通量測序方法，篩選尿液中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本[4]，發(fā)現(xiàn)lncRNA NONRATT042796表達(dá)上調(diào)，而且是rno-miR- 207的前體序列。本研究分析了rno-miR- 207的表達(dá)及功能，為腎臟纖維化診斷提供潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠，8 周齡，體質(zhì)量190～230 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司 SCXK(京)2015- 0001]。

1.1.2 主要試劑：胎牛血清(10270)、胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；Trizol、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司)；M-MMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑以、轉(zhuǎn)錄緩沖液和RNase-free 水(Promega公司)；dNTP Mix和real-time PCR mix(TaKaRa公司)；TGF-β(Peprotech公司)；miR- 207模擬物mimics及其陰性對照、miR- 207抑制劑及其陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備：腹腔注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉。實(shí)驗(yàn)組大鼠(unilateral ureteral obstruction, UUO)于近腎門處結(jié)扎右側(cè)輸尿管，再于輸尿管遠(yuǎn)離腎門處做2次結(jié)扎。假手術(shù)組只分離右側(cè)輸尿管，不結(jié)扎。腹腔注射等量青霉素后關(guān)閉腹腔。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將miR- 207模擬物mimics及其陰性對照，miR- 207抑制劑及其陰性對照的凍干粉分別用無RNase水溶解。將鋪于6孔板中的細(xì)胞換成新鮮完全培養(yǎng)基，取246 μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基加入4 μL脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，吹打混勻后靜置5 min。另取250 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基加20 nmol/L RNA片段?；靹蚝?，靜置20 min。將轉(zhuǎn)染液加入增殖于6孔板的細(xì)胞中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后加入LPS(1 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。

1.2.3 RNA抽提及質(zhì)檢：收集腎臟組織或尿液，采用Trizol法提取總RNA，使用Nanodrop測定RNA的吸光度值，以計(jì)算濃度并評估純度。用甲醛電泳進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測RNA表達(dá)：采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA(按說明書操作)，紫外分光計(jì)測定RNA濃度，計(jì)算純度，取A260/A280比值為1.8～2.0的RNA樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA第一條鏈的合成按照說明書進(jìn)行。以新合成的cDNA為模板。建立PCR反應(yīng)體系。PCR程序如下：95 ℃ 5 min，40個(gè)PCR循環(huán)(95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 34 s)。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。引物序列見表1。腎臟組織及細(xì)胞的RT-qPCR 結(jié)果由GAPDH 作為內(nèi)參，尿液樣本中的RT-qPCR 結(jié)果由cel-miR- 39 作為內(nèi)參。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR- 207在腎纖維化大鼠腎臟和尿液中表達(dá)均上調(diào)

腎纖維化大鼠的腎臟和尿液中miR- 207的表達(dá)均上調(diào) (圖1)。

*P<0.05 compared with control圖1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR- 207表達(dá)Fig 1 Analysis of miR- 207 expression by real-time

2.2 TGF-β 通路對miR- 207的表達(dá)調(diào)控

TGF-β顯著上調(diào)了miR- 207在大鼠腎小管上皮NRK- 52E 細(xì)胞中的表達(dá)，并呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性和劑量依賴性(作用時(shí)間為12 h) (圖2)。

圖2 在大鼠腎小管上皮NRK52E細(xì)胞中，TGF-β誘導(dǎo)miR- 207的表達(dá)Fig 2 TGF-β induced miR- 207 expression in NRK52E cells

2.3 對纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響

分別將miR- 207模擬物mimics、抑制劑inhibitor轉(zhuǎn)染大鼠腎小管上皮NRK- 52E細(xì)胞，二者可有效影響細(xì)胞中miR- 207的表達(dá)水平(圖3)。細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR- 207 mimics后TGF-β誘導(dǎo)的Col1a1, Col3a1, Ctgf和Fn1的基因表達(dá)增加，而敲低miR- 207后TGF-β誘導(dǎo)的Col1a1, Col3a1, Ctgf和Fn1的基因表達(dá)被抑制(圖4)。

圖3 miR- 207 mimics和inhibitor對大鼠腎小管上皮NRK52E細(xì)胞中miR- 207的影響Fig 3 miR- 207 mimics and inhibitor affected the expression of miR- 207 in NRK52E cells

圖4 miR- 207對腎纖維化相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig 4 miR- 207 affected the expression of gene related to renal fibrosis

3 討論

腎臟纖維化程度與慢性腎臟疾病的治療及預(yù)后密切相關(guān)。目前判定腎臟組織纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)是活體組織檢查。尋找方便、精確的生物標(biāo)志物，對診斷與監(jiān)測腎間質(zhì)纖維化至關(guān)重要[5]。miRNA是一類具有介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，lncRNA是堿基數(shù)大于200個(gè)核苷酸的非翻譯轉(zhuǎn)錄本，通過基因印跡、染色質(zhì)重塑、剪接調(diào)控等多種機(jī)制發(fā)揮功能。

在前期研究中構(gòu)建了大鼠腎臟纖維化模型，利用第2代高通量測序的方法，篩選腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展過程中尿液中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)lncRNA NONRATT042796表達(dá)上調(diào)，是rno-miR- 207的前體序列。利用Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR- 207的靶分子，發(fā)現(xiàn)其與TGIF2 3′UTR區(qū)存在相互結(jié)合位點(diǎn)。TGIF2可作為共轉(zhuǎn)錄因子抑制TGF-β信號(hào)通路,后者與纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Smad蛋白活化[6- 9]。此外，研究發(fā)現(xiàn)TGIF2可抑制角膜基質(zhì)細(xì)胞的纖維化表型[10]。上述研究提示miR- 207可能與腎臟纖維化相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過研究rno-miR- 207的表達(dá)及功能，為腎臟纖維化的診斷提供潛在生物標(biāo)志物。

首先利用RT-qPCR方法檢測腎纖維化大鼠腎臟和尿液中miR- 207的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR- 207的表達(dá)水平均上調(diào)。還發(fā)現(xiàn)TGF-β能顯著上調(diào)miR- 207在大鼠腎小管上皮NRK- 52E 細(xì)胞中的表達(dá)，并有時(shí)間和劑量依賴性。說明TGF-β通路可能參與了對miR- 207的表達(dá)調(diào)控。

腎臟纖維化表現(xiàn)為正常腎單位丟失，成纖維細(xì)胞增生，功能缺失以及膠原蛋白和纖連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)堆積等。TGF-β在纖維化過程中能夠誘導(dǎo)纖維化相關(guān)蛋白Col1a1, Col3a1, Ctgf和Fn1的表達(dá)[8,11]。向NRK- 52細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR- 207 mimics或inhibitor觀察miR- 207對纖維化相關(guān)基因的影響。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR- 207 mimics后TGF-β誘導(dǎo)的Col1a1,Col3a1,Ctgf和Fn1的基因表達(dá)增加，而敲低miR- 207后TGF-β誘導(dǎo)的基因表達(dá)被抑制。說明miR- 207在TGF-β調(diào)控的纖維化過程中有重要的作用。

以上結(jié)果表明miR- 207在腎臟纖維化發(fā)生過程中的功能可能由TGF-β/Smad 信號(hào)調(diào)控，并對纖維化相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，可能形成一個(gè)腎臟纖維化調(diào)節(jié)反饋回路，為腎臟纖維化診斷提供新的方法。

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