王維斌， 董良博， 趙邦博， 盧 軍， 趙玉沛

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 基本外科， 北京 100730)

胰腺癌發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，早期診斷困難，目前仍然排在全世界癌相關(guān)死亡的第4位[1]。胰腺癌手術(shù)切除率為9%～36%，接受手術(shù)治療患者的5年生存率也只有19%～24%[2]。膽汁酸(bile acids, BAs)的主要生物學(xué)功能是在體內(nèi)乳化并溶解脂肪聚合物，是膽固醇在體內(nèi)的主要代謝途徑。法尼醇X受體(farnesoid X receptor, FXR)是BSA的關(guān)鍵核受體，調(diào)節(jié)BAs、脂類和糖代謝平衡，參與膽汁淤積、非酒精性脂肪肝、肝細(xì)胞再生、小腸細(xì)菌屏障生長(zhǎng)和炎性腸病等疾病的發(fā)病機(jī)制[3- 4]。

近年來，諸多研究表明FXR與肝腺癌、肝膽管細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膽管癌的發(fā)生機(jī)制、化療敏感性和預(yù)后均有密切關(guān)系[5- 7]。但FXR在胰腺癌方面的相關(guān)研究較少。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人胰腺癌細(xì)胞系A(chǔ)sPC- 1、BxPC- 3、Capan- 1、Colo- 357、MIA PaCa- 2、Panc- 1、SU86.86和T3M4由本實(shí)驗(yàn)室保存。收集2005年1月至2010年12月在北京協(xié)和醫(yī)院就診，并最終診斷為胰腺癌患者組織標(biāo)本共50例和正常胰腺組織標(biāo)本5名(全部患者均簽署知情同意書，本實(shí)驗(yàn)獲得北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn))。胰腺癌患者年齡為45～78歲，平均57.5歲，其中男性26例、女性24例。

Real-time PCR試劑盒(Trizol Reagent)、TaqMan探針、RPMI 1640和 trypsin-EDTA(Invitrogen公司)； KAPA PROBE FAST qPCR Kits (Kapa Biosystems公司)；兔抗人FXR多克隆和鼠抗人GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和real-time PCR： 應(yīng)用Trizol reagent試劑盒，按照說明書抽提處于對(duì)數(shù)增殖期的8種胰腺癌細(xì)胞的總RNA，測(cè)定RNA濃度，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用Bio-Rad CFX96 real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，循環(huán)擴(kuò)增條件：95 ℃、10 min變性，然后95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。FXR引物：上游引物5′-AGAAACAGTGTCCGTAGAGC-3′，下游引物5′-GCAG ACCACACACAGCTCAT-3′。

1.2.2 Western blot：大量收集6孔板中處于對(duì)數(shù)增殖期的8種胰腺癌細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。加兔抗人FXR多克隆抗體在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜,羊抗兔IgG抗體在室溫下孵育1 h，兔抗人FXR多克隆抗體按照1∶500稀釋應(yīng)用，鼠抗人GAPDH單克隆抗體按1∶5 000稀釋應(yīng)用。

1.2.3 免疫組化染色及評(píng)分系統(tǒng)：兔抗人FXR多克隆抗體按照1∶200進(jìn)行稀釋應(yīng)用，免疫組化具體實(shí)驗(yàn)步驟如前所述[8]。邀請(qǐng)兩位病理科醫(yī)生獨(dú)立分別針對(duì)FXR染色的強(qiáng)度及范圍進(jìn)行評(píng)分。染色強(qiáng)度評(píng)分情況如下，無染色：0分；弱：1分； 中度：2分；高度：3分。染色范圍評(píng)分情況如下，<5%：0分；5%～25%：1分；>25%～50%：2分；≥50%～75%：3分；>75%：4分。然后，取兩者的乘積得到最終總評(píng)分，并按照分?jǐn)?shù)高低將樣本分為FXR低度表達(dá)組 (<4分)和FXR高度表達(dá)組 (≥4分)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FXR在胰腺癌8種細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平

FXR蛋白在胰腺癌細(xì)胞中普遍表達(dá)，其中在Canpan- 1和T3M4中高度表達(dá)，而在MiaPaCa- 2和Panc- 1細(xì)胞中相對(duì)表達(dá)較低，與real-time PCR結(jié)果相似(圖1)。

A.Western blot results showed that FXR protein was highly expressed in pancreatic cancer cells Canpan- 1 and T3M4, while in MiaPaCa- 2 and Panc- 1 cells, FXR was lowly expressed; B.real-time PCR results showed that FXR mRNA was also highly expressed in pancreatic cancer cells Canpan- 1 and T3M4, and was lowly expressed in MiaPaCa- 2 and Panc- 1 cells, accordant with Western blot results;*P<0.05,**P<0.01 compared with Aspc1 mRNA expression

圖1應(yīng)用Westernblot和real-timePCR方法檢測(cè)FXR在8株胰腺癌細(xì)胞中的蛋白及mRNA表達(dá)水平

2.2 檢測(cè)FXR在正常胰腺組織和胰腺癌組織中的蛋白表達(dá)水平

FXR在正常胰腺組織中普遍表達(dá)水平較低(圖2A)，而在胰腺癌細(xì)胞中呈不同程度的胞質(zhì)和細(xì)胞核高表達(dá)(圖2B～D)。FXR在胰腺胰島細(xì)胞中亦呈普遍高表達(dá)(圖2E)，F(xiàn)XR在胰腺神經(jīng)組織內(nèi)表達(dá)陰性(圖2F)。

2.3 FXR蛋白表達(dá)水平與胰腺癌患者的病理G分期及生存時(shí)間密切相關(guān)

FXR的蛋白表達(dá)水平與患者病理G分期密切相關(guān)(P<0.05)，即病理分化差的G3期胰腺癌組織中，F(xiàn)XR蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低。FXR蛋白表達(dá)水平與病理G分期均為胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素(P<0.05)。胰腺癌FXR高表達(dá)患者的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于FXR低表達(dá)患者(P<0.05)(圖3和表1)。

3 討論

FXR是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體超家族成員之一，在體內(nèi)主要負(fù)責(zé)膽汁酸的代謝平衡穩(wěn)定，本文重點(diǎn)討論FXR在腫瘤發(fā)生、發(fā)展機(jī)制方面的生物學(xué)功能。FXR可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化，F(xiàn)XR通過下調(diào)EGFR磷酸化和ERK活性來抑制小腸上皮細(xì)胞增殖和腫瘤的發(fā)生[9]。應(yīng)用法尼醇直接刺激胰腺癌BxPC3細(xì)胞，可以顯著誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)伴隨凋亡相關(guān)Bak基因表達(dá)上調(diào)[10]。FXR的表達(dá)水平與胰腺癌細(xì)胞的侵襲性呈負(fù)相關(guān)，即對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑制作用[11]。FXR在結(jié)腸癌組織中低度表達(dá)，而在癌旁組織中的表達(dá)水平相對(duì)較高，與結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間呈正相關(guān)[12]。

A.localization of FXR in plasmalemma and cell nucleus of normal pancreatic duct cells showed negative staining; B.weak expression of FXR in pancreatic cancer cells; C.moderate expression of FXR in pancreatic cancer cells; D.strong experssion of FXR in pancreatic cancer cells; E.moderate expression of FXR in pancreatic islet cells; F.no staining in pancreatic nerves; immunohistochemistry was performed with FXR(1∶200)

圖2免疫組化方法檢測(cè)FXR在正常胰腺組織和胰腺癌組織中的定位與蛋白表達(dá)

Fig2FXRlocationandexpressioninnormalpancreatictissuesandpancreaticcancertissueswithIHCs(×50)

A.survival time of pancreatic cancer patients with high FXR expression was obviousely longer than those patients survival time with low FXR expression, FXR expression was closely positive related with survival time of pancreatic cancer patients(P<0.05); B.survival time of pancreatic cancer patients with pathological grade G1/G2 was apparently longer than those patients with pathological grade G3(P<0.05)

圖3Kaplan-Meier和log-rank方法對(duì)預(yù)后因素應(yīng)用COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行多因素分析

Fig3Kaplan-Meierandlog-rankanalysesofprognosticfactorsassessedinamultivariableanalysisusingaCoxproportionalhazardsmodel

FXR表達(dá)上調(diào)可以明顯抑制肝癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖速度[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與報(bào)道完全一致，F(xiàn)XR的表達(dá)水平與胰腺癌病理G分期密切相關(guān)，而且與胰腺癌患者的生存時(shí)間呈顯著性正相關(guān)，是胰腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

亦有研究報(bào)道在其他腫瘤中，F(xiàn)XR卻發(fā)揮著相反的生物學(xué)功能，F(xiàn)XR在乳腺癌細(xì)胞及組織中高表達(dá)，可以促進(jìn)乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及通過與雌激素受體(estrogen receptor, ER)的相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[14]； FXR在食管癌細(xì)胞中高度表達(dá)，并且與腫瘤的病理分化程度差、腫瘤體積大和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著性正相關(guān)[15]。

表1 FXR表達(dá)水平與患者臨床資料的相關(guān)性分析

*P<0.05 compared with normal pancreatic tissue.

綜上，諸多研究證明FXR確實(shí)在不同類型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制中均發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能，其作用機(jī)制尚不清楚。而且，膽汁酸在體內(nèi)代謝除了熟知的核受體FXR，還有膜受體TGF5(G protein-coupled receptor，TGR5)，同樣發(fā)揮著紛繁復(fù)雜的生物學(xué)功能，需要進(jìn)一步地深入研究和探索。

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新聞點(diǎn)擊

頭痛可以怪罪甲狀腺問題

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 10- 10)報(bào)道，新近研究指出，有偏頭痛或其他頭痛問題的人罹患甲狀腺功能低下的風(fēng)險(xiǎn)較高。

當(dāng)身體無法產(chǎn)生足夠甲狀腺激素時(shí)，就會(huì)發(fā)生甲狀腺功能低下，根據(jù)辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究人員指出，這會(huì)造成情緒波動(dòng)、體質(zhì)量增加、掉發(fā)、疲勞、便秘、以及月經(jīng)周期不規(guī)律等問題。

調(diào)查人員發(fā)現(xiàn)，有類似叢集性頭痛或緊張性頭痛等原發(fā)性頭痛者，甲狀腺功能低下的風(fēng)險(xiǎn)高了21%；可能有偏頭痛的人風(fēng)險(xiǎn)高了41%。

研究結(jié)果顯示，有偏頭痛的人特別容易有甲狀腺機(jī)能低下是什么讓頭痛與甲狀腺機(jī)能低下有關(guān)，尚不清楚。

這篇研究刊登在2016- 09- 27《頭痛：頭部與臉部疼痛》。

兒童時(shí)期創(chuàng)傷導(dǎo)致早衰

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 10- 13)報(bào)道，新近研究指出，兒童時(shí)期的創(chuàng)傷可能促使細(xì)胞老化速度加快。

加拿大溫哥華英國(guó)哥倫比亞大學(xué)健康老化與壓力實(shí)驗(yàn)室主任Eli Puterman認(rèn)為，孩童時(shí)曾經(jīng)歷過壓力的成人似乎其染色體尾端的端粒變短的風(fēng)險(xiǎn)增加，這可能會(huì)增加生病以及成人時(shí)期早死的風(fēng)險(xiǎn)。

Puterman主任強(qiáng)調(diào)，細(xì)胞老化比較快是相對(duì)的。這只代表風(fēng)險(xiǎn)有增加。并不是每個(gè)幼年時(shí)期曾有創(chuàng)傷的人每個(gè)人都會(huì)在晚年以生病終了。

Puterman解釋，端粒就像是鞋帶兩端的塑料頭，它可以避免鞋帶磨損。在這個(gè)案例中，端?？杀苊馊祟惾旧w散開，防止細(xì)胞比較快老化與死亡。

Puterman與同事們?cè)u(píng)估了近4 600例以后發(fā)現(xiàn)，幼兒時(shí)期每經(jīng)歷一件明顯有壓力的事情，可能使端粒變短的風(fēng)險(xiǎn)增加11%。

根據(jù)報(bào)告指出，有壓力的事情包括父母親吸毒或酗酒、虐待、違法、留級(jí)、或是家中經(jīng)濟(jì)困難。

沒有人能完全解釋這個(gè)原因，但Puterman認(rèn)為，這可能是因?yàn)閼?zhàn)斗或逃跑激素在有大量壓力產(chǎn)生時(shí)釋放，這些激素會(huì)磨損免疫系統(tǒng)，因此它不是立刻就磨損人的細(xì)胞與染色體。

這些研究結(jié)果刊登在2016- 10- 03《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》。