蔡志宏，曹怡靜，劉 姣，胡皓彬，謝 鑫，許雄峰，凌 暉*

(南華大學 醫(yī)學院 1.腫瘤研究所；2.2016級卓越醫(yī)師班，湖南 衡陽 421001)

胃癌不僅在中國人群中的發(fā)病率很高，也是全球最常見的癌致死原因[1]。胃癌治療新手段的研究，已成胃癌防治領域新興的研究焦點。胃動蛋白- 2(gastrokine- 2,GKN2)屬于分泌蛋白家族，其在正常胃黏膜組織中高表達，而在胃癌中表達下調或不表達，提示GKN2可能作為候選腫瘤抑制基因在胃癌發(fā)生中起作用[2- 3]。研究發(fā)現(xiàn)GKN2特異性表達于胃黏膜組織[4]，GKN2表達缺失與胃癌發(fā)生密切相關，并提示將來臨床上有望通過恢復GKN2表達的治療策略來抑制胃癌發(fā)生發(fā)展[5]。

本研究首先觀測GKN2在胃癌中的表達轉變，接著經轉染GKN2使其高表達，驗證其對人胃癌MKN28細胞增殖、侵襲和遷移的抑制作用，為GKN2在胃癌變過程中作用的深入探尋提供實驗證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例標本及MKN28細胞系：標本來自南華大學附屬一醫(yī)院，其中胃癌90例、癌旁組織48例、胃癌遠端胃黏膜(從距腫瘤邊緣>5 cm處取得)組織22例。90例胃癌標本中，高分化腺癌20例、中分化腺癌29例、低分化腺癌21例、黏液腺癌11例、印戒細胞癌9例。該實驗已獲南華大學倫理委員會的審查批準書及受試者簽署的知情同意書。人胃癌MKN28細胞系來自本研究所保存。

1.1.2 試劑：免疫組化Ultrasensitive TM SP 試劑盒、DAB染色試劑盒(邁新生物技術有限公司)；Xhol_GKN3SP-hGKN2-TEV-SBP_Xhol表達載體和pCAGGS-Neo vector空載體由本所構建；兔抗人GKN2單克隆抗體、兔抗人β-actin單克隆抗體、兔二抗等(Abcam公司)；MTT細胞增殖檢測試劑盒(碧云天生物技術公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學檢測GKN2表達：采取LSAB法(又稱鏈酶親和素過氧化物酶法)進行實驗，PBS(替代一抗)為陰性對照，依據(jù)Ultrasensitive TM SP 試劑盒說明書實施步驟。蘇木精染色1 min, 自來水沖洗10 min，鹽酸分化10 s，自來水返藍5 min。脫水并中性樹膠封片。顯微鏡下觀察：陽性細胞的胞質中顯示黃色或棕黃色者。結果判定：每一個高倍鏡下陽性細胞數(shù)<5為陰性，≥5為陽性。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及重組質粒轉染細胞：用含10%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基(青霉素、鏈霉素各100 U/mL)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)細胞，待細胞增殖至80%左右匯合時傳代。使用Lipofectamine 2000進行轉染，G418篩選，獲得穩(wěn)定高表達GKN2的MKN28細胞株，實驗分為GKN2轉染組、未轉染組和空載體組。

1.2.3 Western blot驗證GKN2蛋白的表達：提取各組細胞總蛋白，用BCA法進行蛋白定量，以30 μg總蛋白/孔的量在10% SDS-PAGE進行電泳，轉膜，封閉，加一抗(GKN2，1∶1 000；β-actin，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后，加二抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光劑顯影，拍照，AlphaImager 2200軟件對結果進行分析。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖：取對數(shù)增殖期細胞，由胰蛋白酶消化制備單細胞懸液(1×104cells/mL)，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔注入200 μL細胞懸液(含2 000個細胞)，設立空載體組、未轉染組和調零組，貼壁后在孔中培養(yǎng)24、48和72 h后，每孔添加10 μL MTT液(5 g/L)，在細胞培養(yǎng)箱內再溫育4 h即停止培養(yǎng)，然后每孔添加100 μL DMSO以便溶解，經由10 min左右振蕩，置酶聯(lián)免疫檢測儀測定A值(每孔取5個復孔)。

1.2.5 Transwell遷移實驗檢測細胞遷移：首先用胰蛋白酶消化各組MKN28細胞，加入無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液；Transwel小室分為上下兩室，在下室之中加入500 μL含血清的培養(yǎng)基(血清和培養(yǎng)基的加入比例為1∶9)，在上室中加入細胞懸液200 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell小室，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，結晶紫染色15 min，在倒置顯微鏡下進行觀察。隨機選取5個高倍鏡視野，照相并計數(shù)。

1.2.6 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲：將液態(tài)的BD基質膠與無血清培養(yǎng)基(依照1∶5的比例)混勻，吸400 μL注入Transwell上室，置于細胞培養(yǎng)箱中2 h，導致薄層凝膠產生。其他步驟同遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 GKN2蛋白在胃組織中的表達

GKN2蛋白在癌旁組織中表達明顯弱于胃癌遠端胃黏膜(P<0.05)。GKN2蛋白在胃癌組織中表達均顯著低于胃癌遠端胃黏膜(P<0.01)和癌旁組織(P<0.01)(表1)。

表1 GKN2蛋白在胃癌遠端胃黏膜、癌旁和胃癌組織中的表達

DGM.distal gastric mucosa; AT.the adjacent tissues; GC.gastric cancinoma;*P<0.05 compared with DGM;#P<0.05 compared with AT.

2.2 Western blot驗證轉染前后GKN2蛋白表達的變化

與未轉染組和空載體組相比，轉染GKN2的MKN28細胞中GKN2蛋白表達明顯增加(P<0.05)(圖1)。

2.3 過表達GKN2對人胃癌MKN28細胞增殖的影響

與未轉染的細胞和空載體組的細胞相比，轉染GKN2的細胞在轉染24 h后細胞存活率(A值)開始減低，48 和72 h后更顯著，呈現(xiàn)時間依賴關系(P<0.05)(表2)。

A.untransfected cells group； B.empty vector group；C.GKN2-transfected group; *P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group圖1 GKN2轉染前后MKN28細胞中GKN2蛋白表達情況Fig 1 Expression of GKN2 protein in MKN28 cells with or without n=3)

24 hours48 hours72 hoursuntransfected cells0.24 ±0.030.44 ±0.020.63±0.03 empty vector0.25 ±0.040.49 ±0.060.65 ±0.21 GKN2-transfected0.15±0.02*0.22 ±0.06*0.25±0.05*

*P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group.

2.4 過表達GKN2對人胃癌MKN28細胞遷移能力的影響

顯微鏡下(放大倍數(shù)×200)觀察并計算遷移細胞數(shù)：從Transwell小室的上層(無血清培養(yǎng)基)經聚碳酸酯膜遷移到下層(血清培養(yǎng)基)的細胞數(shù)，細胞染成紫色，GKN2轉染組遷移細胞數(shù)比未轉染組和空載體組顯著減少(P<0.05)(圖2)。

2.5 過表達GKN2對人胃癌MKN28細胞侵襲能力的影響

GKN2轉染組MKN28細胞中穿過基質膠的細胞數(shù)明顯少于未轉染組和空載體組(P<0.05)(圖3)。

A.untransfected cells group； B.empty vector group；C.GKN2-transfected group;*P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group

A.untransfected cells group； B.empty vector group；C.GKN2-transfected group;*P<0.05 compared with untransfected cells group and empty vector group

3 討論

研究表明，在正常人胃黏膜中GKN2高表達，但在幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)感染直到胃部腫瘤形成的過程中，GKN2呈現(xiàn)出表達逐漸下調，且根除Hp后，GKN2表達上調是最明顯的[6]。本實驗結果也發(fā)現(xiàn)，GKN2在胃癌遠端胃黏膜中顯著高表達，而在癌旁組織和胃癌組織中呈漸進性的表達下調，說明GKN2參與胃癌的發(fā)生過程，可能作為候選抑瘤基因發(fā)揮作用，因此在胃癌中表達明顯下調。

GKN2在胃癌細胞系中均表達下調或不表達[7]。那么使GKN2恢復表達是否具有抑制胃癌細胞的增殖的作用？基于此，本實驗將GKN2高表達載體轉染到人胃癌MKN28細胞中，證實細胞增殖明顯受到抑制。有研究者發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路是調節(jié)GKN2轉錄的關鍵點之一[5]，由此推測GKN2抑制胃癌細胞增殖的作用是否與STAT3有關？在哺乳動物體內GKN2是否也具有抑制癌細胞增殖的作用呢？GKN2是通過哪些信號途徑來抑制胃癌細胞增殖的呢？這些都有待于進一步的研究證實。

目前研究已經證實，GKN1可以抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[8]，那么GKN2是否也有相同的作用呢？本實驗結果發(fā)現(xiàn)，GKN2過表達對胃癌細胞遷移和侵襲有顯著阻滯作用，說明GKN2與GKN1一樣具有抑制胃癌細胞遷移與侵襲作用。遷移和侵襲的活化是癌轉移起始的標志之一。侵襲和轉移過程極其復雜，包括癌細胞分泌多種蛋白酶對抗細胞外基質(ECM)的降解。最近有報道發(fā)現(xiàn)GKN2可抑制胃癌細胞EMT(上皮間質轉換)，其機制可能是通過PI3K/AKT/GSK3β信號通路下調snail的表達[9]。GKN2也可能通過與TFF1相互作用協(xié)同起到抗胃癌細胞增殖和促凋亡的作用[10]。GKN2抑制胃癌細胞遷移與侵襲的機制還未完全闡明，將進一步進行探究。根據(jù)以上研究結果，認為GKN2在胃癌中是一個有潛力的腫瘤抑制基因，恢復GKN2表達也許是治療胃癌的新策略。詮釋GKN 2的作用機制將有助于進一步闡明胃癌的發(fā)病機制，為發(fā)現(xiàn)胃癌防治的分子靶點提供依據(jù)，因此值得進一步深入開展研究。

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