馬成，馬孫強，李濟宇

（1.安徽醫(yī)科大學上海臨床學院，上海 200072；2.上海市第十人民醫(yī)院，上海 200072）

自噬是細胞內(nèi)最重要的house-keeping的功能之一。自噬通過依賴溶酶體降解或消化細胞內(nèi)受損的器官和蛋白或入侵微生物來獲取再生的能量：先圍圈這些物質(zhì)形成雙膜的隔間被稱為“自噬體”之后被溶酶體消化。當細胞面對外源壓力比如營養(yǎng)缺乏時，啟動自噬補充細胞所需的營養(yǎng)是細胞生存的重要手段[1-2]。

自噬和人類疾病的關系是近年來的研究熱點。研究已經(jīng)明確自噬是人體引發(fā)免疫功能和清除病原體所必需的[3-6]。自噬是細胞生存的重要途徑，但其與細胞死亡的關系不清楚[7]。尤其是腫瘤細胞的自噬以及其和對抗營養(yǎng)缺乏的分子途徑了解很少[8-10]。

研究表明，ATG5是細胞自噬途徑中非常關鍵的蛋白。自噬體形成中需要二組接合（conjugation）系統(tǒng)（ATG12和ATG8）的協(xié)同作用，這二組接合系統(tǒng)都需要ATG5的參與[11-12]。缺乏ATG5導致小鼠B細胞發(fā)育不全[13]，小鼠出生后立刻死亡[14-15]。

p53是細胞中最負盛名的腫瘤抑制因子，在60%以上人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)該基因存在突變[16]。在細胞內(nèi)，p53會誘導p21（cip1/waf1）這個下游產(chǎn)物的表達來抑制細胞增殖[17-18]。p21（cip1/waf1）是細胞中重要的細胞周期的負調(diào)控蛋白質(zhì)（CDKI）。通過與細胞周期中的cyclins/CDKs形成復合物從而抑制Rb的磷酸化從而使細胞停留在G1或者G2期[19-20]?，F(xiàn)在有很多研究證明，p21（cip1/waf1）在很多生物環(huán)境中幫助腫瘤的生存。

本研究將小鼠正常肝細胞AML-12、肝癌細胞Hepa 1-6在缺血條件下進行培養(yǎng)，探討自噬基因ATG5在腫瘤細胞中對抗營養(yǎng)危機的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠細胞系AML-12和Hepa 1-6（中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫），胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)液、1000×青霉素/鏈霉素溶液及0.25%含EDTA胰酶（美國Gibico公司），Lipofectamine?3000試劑、二氧化碳CO2無菌培養(yǎng)箱和實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（美國Thermo公司）；ATG5、p21小干擾 RNA（si-ATG5，si-p21）、對照小干擾 RNA（si-con）及ATG5過表達質(zhì)粒（上海捷瑞生物工程有限公司構建），RNAiso plus、逆轉錄試劑盒及SYBR?Green染料（大連寶生物工程有限公司），定量引物（上海捷瑞生物工程有限公司），碘化丙啶（PI）、RNase A、Triton X-100、RIPA裂解液及CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗人ATG5單克隆抗體、兔抗人p21單克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體及抗鼠兔二抗（美國Abcam公司），PVDF膜（德國merckmillipore公司），酶標儀（美國Biotek公司），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR公司），流式細胞儀（美國BD biosciences公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞株和細胞培養(yǎng) 小鼠的AML-12和Hepa 1-6細胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，覆蓋率達80%～90%進行細胞傳代；實驗過程所需材料（血清和培養(yǎng)基除外）均需放置在超凈臺上并用紫外燈照射30 min滅菌，先用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶瓶蓋，打開后瓶口在酒精燈上過火焰，再用吸管輕輕吸出舊的培養(yǎng)液至廢液缸，加入2 ml無菌PBS洗1次；加入1 ml的2.5%胰蛋白酶-EDTA消化液于37℃消化細胞數(shù)分鐘。倒置顯微鏡觀察到細胞突起消失變圓后，加入等體積的培養(yǎng)基（10% FBS+100 u/ml青霉素+100 u/ml鏈霉素+90% DMEM/F12培養(yǎng)基）終止消化。用移液槍吹打細胞，使其懸浮，將細胞吸到15 ml的離心管中，用培養(yǎng)基清洗培養(yǎng)瓶合并入離心管，1 000 r/min 5 min。棄上清液至廢液缸，加入1 ml培養(yǎng)基，將細胞混勻成細胞懸液，以1∶2或1∶3進行傳代，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞處于對數(shù)生生長期時，進行缺血處理或者其他后續(xù)實驗。對處于對數(shù)生長期的細胞進行缺血培養(yǎng)實驗，將培養(yǎng)基換成90% DMEM/F12培養(yǎng)基+100 u/ml青霉素+100 u/ml鏈霉素的無血清培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后進行后續(xù)實驗作為研究組。以90% DMEM/F12培養(yǎng)基+100 u/ml青霉素+100 u/ml鏈霉素的含血清培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，作為對照組。

1.2.2 轉染質(zhì)粒及si-RNAs 細胞轉染應用Lipofectamine ?3 000試劑，按照用戶手冊進行轉染。轉染質(zhì)粒時6孔板每孔5 μl Lipofectamine?3 000+5 μl P3 000轉染試劑+2 500 ng目的質(zhì)粒，轉染si-RNA時6孔板每孔5 μl Lipofectamine?3 000+75 pmol目的si-RNAs。

1.2.3 細胞的RNA提取和qRT-PCR分析 待細胞轉染24 h后，收集各組細胞，用TaKaRa公司的RNAiso plus試劑按照操作手冊提取細胞總RNA；取1 μg RNA逆轉錄得到cDNA，用SYBR Green染料檢測ATG5或p21 mRNA的表達水平。ATG5 mRNA正向引物：5'-GAAAGAGTGTGTCCTCCTCG-3'，反向引物：5'-TTGCCTCCACTGAACTTGAC-3'；p21正向引物：5'-CTTGCACTCTGGTGTCTGAG-3'，反向引物：5'-CTGCGCTTGGAGTGATAGAA-3'；內(nèi)參引物 GAPDH正向引物：5'-GCAAAGTGGAGATTGTTGCC-3'，反向引 物：5'-TTGAATTTGCCGTGAGTGGA-3'。ATG5或p21 mRNA轉錄水平的相對表達量用2-ΔΔCt法分析。

1.2.4 CCK-8法檢測轉染后細胞增殖能力變化 胰酶消化對數(shù)生長的細胞，收集細胞并進行細胞計數(shù)，每孔種3×103個細胞于96孔細胞板內(nèi)每組設6個復孔，在每組實驗細胞周圍的孔加10 μl PBS于7℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞缺血培養(yǎng)或者轉染24 h后檢測細胞增殖活性，檢測前在每個待檢測孔加入10 μl CCK-8，將細胞板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，在全自動酶標議上測定各孔吸光度值（450 nm為測定波長，630 nm為參比波長）。細胞生長抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.2.5 Western bolt檢測蛋白表達 收取各組細胞，用冰浴的PBS洗滌2次；加入RIPA裂解液收取總蛋白，測定蛋白濃度；將30 μg蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封1 h，4℃下結合ATG5、p21或GAPDH（內(nèi)參）一抗過夜；PBST洗3次，室溫結合二抗1 h；PBST洗3次，Odyssey顯影，凝膠成像儀對蛋白條帶進行灰度分析，計算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的灰度值比值。

1.2.6 細胞周期實驗 細胞轉染后24 h后每樣收集1×106個細胞，離心收集細胞，棄上清液，用預冷PBS洗細胞2次，加入預冷70%乙醇，于4℃固定過夜，或置入-20℃長期固定。離心收集細胞，以1ml的PBS洗細胞1次，加入500 μl PBS含50 μg/ml碘化丙啶（PI），100 μg/ml RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30 min。以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù)2萬～3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析，若方差齊，則兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種細胞缺血培養(yǎng)的增殖情況

缺血24 h后AML-12細胞和沒有全營養(yǎng)的對照比較，細胞的死亡增加近10%；而Hepa1-6的24 h缺血導致的死亡增加約3%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩種細胞缺血處理后與對照細胞的死亡率比較（n =6，%，±s）

表1 兩種細胞缺血處理后與對照細胞的死亡率比較（n =6，%，±s）

組別 AML-12 Hepa1-6對照組 2.488±0.652 1.888±0.584研究組 12.163±1.056 4.758±0.425差值 9.675±0.404 2.870±0.159 t值 19.091 8.031 P值 0.000 0.000

2.2 兩種細胞缺血對內(nèi)源ATG5表達的影響

與對照組比較，缺血24 h后AML-12細胞內(nèi)的自噬相關基因ATG5的表達升高約1倍；而Hepa1-6細胞缺血24 h導致ATG5基因表達升高近4倍，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖1A和表2）。Western blot的結果顯示，缺血24 h后AML-12細胞內(nèi)的自噬相關蛋白ATG5的表達升高達1.6倍。而Hepa1-6細胞的缺血24 h導致ATG5蛋白表達升高達4.5倍（見圖1B）。

2.3 轉染si-RNAs、質(zhì)粒后Hepa1-6細胞的增殖情況

轉染si-RNAs后，與對照組比較兩種細胞ATG5蛋白表達降低60%以上（見圖2A）。轉染si-RNAs后兩種細胞缺血培養(yǎng)24 h，與對照組比較，AML-12細胞的死亡未增加（P＞0.05）；而Hepa1-6細胞死亡升高13%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（見圖2B和表3）。轉染外源ATG5基因表達的質(zhì)粒后，與對照組比較，ATG5蛋白表達升高達4.3倍（見圖2C）。轉染質(zhì)粒后Hepa1-6細胞缺血培養(yǎng)24h，細胞死亡百分率為（2.413±0.601）%，與對照組（5.542±0.838）%比較，降低3.1%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.168，P=0.000）（見圖2D）。

2.4 ATG5對細胞周期抑制蛋白p21（cip1/waf1）的影響

圖1 兩種細胞缺血處理后對內(nèi)源ATG5表達的影響

表2 兩種細胞缺血處理后ATG5的表達比較（n =6，%，±s）

表2 兩種細胞缺血處理后ATG5的表達比較（n =6，%，±s）

細胞 AML-12 Hepa1-6對照組 1.000±0.000 1.000±0.000研究組 1.953±0.392 4.825±0.467差值 0.953±0.392 3.825±0.467 t值 7.041 20.078 P值 0.000 0.000

轉染外源ATG5表達的質(zhì)粒后，p21（cip1/waf1）mRNA表 達（2.397±0.212）%，與對照組（1.000±0.000）%比較升高達2.4倍，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=16.173，P=0.000）（見圖3A）。細胞內(nèi)源p21（cip1/waf1）蛋白表達升高達3.5倍（見圖3B）。流式細胞儀測定顯示，Hepa1-6細胞的細胞周期G1期從空載體的（31.467±1.583）%升高到ATG5轉染的（38.067±1.780）%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=6.787，P=0.000）（見圖3C）。si-RNAs沉默p21（cip1/waf1）后p21蛋白的表達降低（見圖3D）。轉染si-RNAs后細胞缺血培養(yǎng)24h，細胞死亡率（15.085±1.156）%，與對照組（4.792±0.609）%比較增加了10%，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.297，P=0.000）（見圖3E）。

圖2 轉染si-RNAs、質(zhì)粒后細胞增殖比較

表3 兩種缺血處理細胞下調(diào)ATG5后與對照組細胞的死亡率比較 （n =6，%，±s）

表3 兩種缺血處理細胞下調(diào)ATG5后與對照組細胞的死亡率比較 （n =6，%，±s）

細胞 AML12 Hepa1-6對照組 12.200±0.460 4.792±0.609 ATG5下調(diào)組 12.167±0.638 18.108±1.138差值 0.033±0.178 13.316±0.529 t值 0.104 20.078 P值 0.919 0.000

3 討論

肝臟作為體內(nèi)最重要的代謝器官，本身可能會發(fā)生代謝失衡，特變是在慢性肝病中會伴有大量的肝臟細胞自噬和凋亡，自噬與凋亡的失衡也可導致肝臟疾病的發(fā)生，肝損傷的病理特征多為肝細胞的自噬與凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，自噬失調(diào)與病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、酒精性肝病、纖維化、肝硬化和肝細胞癌有關[9-10]，且腫瘤細胞依賴自噬在肝癌中存活[11]。因此研究自噬相關基因與肝臟疾病的關系對了解肝臟疾病顯得尤為重要。

圖3 ATG5對p21（cip1/waf1）的影響

本研究將小鼠正常肝細胞和癌細胞在不同條件下缺血培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)缺血導致一定程度上兩種細胞內(nèi)自噬蛋白ATG5升高，與前人的研究結果相符，即在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中細胞產(chǎn)生應激，啟動自噬，自噬增強，以滿足自身代謝需求[21]。且肝癌細胞Hepa1-6對缺血引起的細胞死亡有抗性。si-RNAs沉默ATG5基因后，可以提高肝癌細胞Hepa1-6對缺血的敏感性。在細胞外源表達ATG5蛋白情況下，會進一步降低細胞對缺血的不敏感性。且ATG5提高細胞內(nèi)細胞周期的抑制蛋白p21（cip1/waf1）的表達，導致細胞滯留在G1期，可能以此逃避缺血帶來的死亡危機。

自噬是細胞通過消耗自體而獲得能量從來尋求生存的分子途徑。腫瘤細胞的自噬和自噬的調(diào)節(jié)的研究還未完全清楚。許多研究也指出，營養(yǎng)剝奪可以誘導自噬并促進肝癌細胞增殖侵襲現(xiàn)象，但其根本的分子途徑并不明確。本研究說明小鼠肝癌細胞通過升高自噬蛋白ATG5的表達來對抗生存環(huán)境中營養(yǎng)缺乏的危機。而且ATG5是通過提高細胞內(nèi)細胞周期的抑制蛋白p21（cip1/waf1）的表達量，從而導致細胞滯留在G1期，可能以此來逃避缺血帶來的細胞死亡危機。

自噬作為細胞內(nèi)的一個重要代謝途徑，其可以抑癌也可以促癌，但在治療腫瘤過程中是促進自噬還是抑制自噬，還有待研究。但不可否認的是與正常組織比較，癌細胞更具有自噬依懶性，說明存在治療窗口。本研究結果提示，自噬基因ATG5在肝癌細胞中發(fā)揮重要作用，ATG5幫助其對抗營養(yǎng)缺乏帶來的生存危機，有望成為治療進展期肝癌的潛在靶點。

[1]MIZUSHIMA N. The pleiotropic role of autophagy: from protein metabolism to bactericide[J]. Cell Death & Differentiation, 2005,12(Suppl 2): 1535.

[2]YORIMITSU T, KLIONSKY D J. Autophagy: molecular machinery for self-eating[J]. Cell Death & Differentiation, 2005, 2(12 Suppl):1542-1552.

[3]LEE H K, LUND J M, RAMANATHAN B, et al. Autophagydependent viral recognition by plasmacytoid dendritic cells[J].Science, 2007, 315(5817): 1398-1401.

[4]LEVINE B, DERETIC V. Unveiling the roles of autophagy in innate and adaptive immunity[J]. Nature Reviews Immunology,2007, 7(10): 767.

[5]TALLOCZY Z, JIANG W, LEVINE B, et al. Regulation of starvation- and virus-induced autophagy by the eIF2 alpha kinase signaling pathway[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 190-195.

[6]GUTIERREZ M G, COLOMBO M I, MASTER S S. Autophagy is a defense mechanism inhibiting BCG and mycobacterium tuberculosis survival in infected macrophages[J]. Cell, 2004,119(6): 753.

[7]LUM J J, BAUER D E, KONG M, et al. Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis[J]. Cell,2005, 120(2): 237.

[8]LIANG X H, JACKSON S, SEAMAN M, et al. Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1[J]. Nature,1999, 402(6762): 672.

[9]VQU X, YU J, BHAGAT G, et al. Promotion of tumorigenesis by heterozygous disruption of the beclin 1 autophagy gene[J]. Journal of Clinical Investigation, 2003, 112(12): 1809.

[10]MATHEW R, KONGARA S, BEAUDOIN B, et al. Autophagy suppresses tumor progression by limiting chromosomal instability[J]. Genes & Development, 2007, 21(11): 1367.

[11]MIZUSHIMA N, YAMAMOTO A B A, HATANO C M, et al.Dissection of autophagosome formation using Apg5-deficient mouse embryonic stem cells[J]. Journal of Cell Biology, 2001,152(4):657-668.

[12]BURMAN C, KTISTAKIS N T. Autophagosome formation in mammalian cells[J]. Seminars in Immunopathology, 2010, 32(4):397-413.

[13]MILLER B C, ZHAO Z, STEPHENSON L M, et al. The autophagy gene ATG5 plays an essential role in B lymphocyte development[J]. Autophagy, 2008, 4(3): 309-314.

[14]KUMA A, HATANO M, MATSUI M, et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period.[J]. Nature, 2004,432(7020): 1032.

[15]HARA T, NAKAMURA K, MATSUI M, et al. Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice.[J]. Nature, 2006, 441(7095): 885.

[16]AYROLDI E, PETRILLO M G, BASTIANELLI A, et al. L-GILZ binds p53 and MDM2 and suppresses tumor growth through p53 activation in human cancer cells[J]. Cell Death & Differentiation,2015, 22(1): 118-130.

[17]LUO Y, HURWITZ J, MASSAGUé J. Cell-cycle inhibition by independent CDK and PCNA binding domains in p21 Cip1[J].Nature, 1995, 375(6527): 159-161.

[18]CAO W, MA S L, TANG J, et al. A combined treatment TNF-alpha/doxorubicin alleviates the resistance of MCF-7/Adr cells to cytotoxic treatment[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2006,1763(2): 182.

[19]LI R, SHOU W, HANNON G J, et al. Differential effects by the p21 CDK inhibitor on PCNA-dependent DNA replication and repair[J]. Nature, 1994, 371(6497): 534-537.

[20]LU Y, YAMAGISHI N, YAGI T, et al. Mutated p21WAF1/CIP1/SDI1 lacking CDK-inhibitory activity fails to prevent apoptosis in human colorectal carcinoma cells[J]. Oncogene, 1998, 16(6): 705-712.

[21]GONG L, DI C, XIA X, et al. AKT/mTOR signaling pathway is involved in salvianolic acid B-induced autophagy and apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J]. Int J Oncol, 2016, 49(6): 2538-2548.