王中山，張夢(mèng)，張美嫻，陳淑漫，朱燾，方佳煒，楊靜，戴毅

1.徐州醫(yī)科大學(xué) a.江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.麻醉學(xué)院；c.臨床學(xué)院；江蘇 徐州 221004；2.徐州市中心醫(yī)院，東南大學(xué)附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，江蘇 徐州 221009

疼痛是一種復(fù)雜的主觀感覺(jué)，包含疼痛感覺(jué)、疼痛情緒和認(rèn)知功能障礙等，作為臨床上最常見(jiàn)的疾病癥狀之一，疼痛嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。為了緩解和治療疼痛，研究人員對(duì)疼痛和鎮(zhèn)痛的機(jī)制做了深入的探索。

實(shí)驗(yàn)室和臨床腦成像研究證實(shí)，前扣帶皮層是疼痛感覺(jué)和調(diào)制的關(guān)鍵腦區(qū)，是調(diào)控生理、病理疼痛狀態(tài)的基礎(chǔ)[1-2]。神經(jīng)元興奮性持續(xù)改變伴隨可塑性改變是前扣帶皮層參與調(diào)節(jié)慢性疼痛的主要機(jī)制[3-5]，這種改變依賴于NMDA受體及其下游信號(hào)通路的調(diào)控[6]。很多證據(jù)顯示NMDA受體2B亞基（NMDAreceptor2Bsubunit，NR2B）介導(dǎo)的前扣帶皮層神經(jīng)元可塑性在炎癥相關(guān)或神經(jīng)損傷相關(guān)持久痛中發(fā)揮重要作用[7-8]，而前扣帶皮層腦區(qū)NR2B參與慢性疼痛的機(jī)制研究顯示微囊蛋白1（caveolin-1）可能參與這一過(guò)程。微囊蛋白1在大腦皮層[9]、海馬[10]、下丘腦[11]等腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞中均有表達(dá)。微囊蛋白1存在于興奮性突觸中，在突觸后密集區(qū)濃度較高，并參與調(diào)控Ⅰ類代謝型谷氨酸受體的轉(zhuǎn)移和信號(hào)傳導(dǎo)[12]。

本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，微囊蛋白1能夠通過(guò)和NR2B之間的相互作用，介導(dǎo)后者的細(xì)胞膜表達(dá)水平，參與突觸的形成和可塑性變化進(jìn)而參與調(diào)節(jié)疼痛，而NR2B羧基端來(lái)源的多肽（NR2Pep）則能夠阻斷這種相互作用[13]，起到很好的鎮(zhèn)痛效果，為慢性神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制研究和臨床治療提供了重要參考。作為一種需要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的多肽，其能否穿過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，是藥物能否起作用的關(guān)鍵。為了幫助多肽等分子較大的藥物穿過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜，在多肽分子上連接穿膜肽是較便捷和安全的方法。

TAT穿膜肽是人類免疫缺陷病毒1（HIV-1）來(lái)源的參與病毒復(fù)制的反式轉(zhuǎn)錄激活蛋白，可作為載體攜帶多肽或蛋白質(zhì)片段[14-15]，以非受體依賴的方式穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。研究證實(shí)，TAT蛋白的穿膜特性主要由其中一段富含精氨酸的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域（YGRKKRRQRRR）介導(dǎo)。TAT短肽能夠介導(dǎo)核酸、蛋白質(zhì)、膠束、脂質(zhì)體、納米顆粒等多種物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞或活體組織，成為目前研究最熱的藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體之一。綠色熒光蛋白（GFP）是一種常用的融合蛋白質(zhì)標(biāo)簽，因其在激發(fā)光下能夠散發(fā)耀眼的綠色熒光，作為報(bào)告標(biāo)簽?zāi)軌蚝芎玫囟ㄎ缓妥粉櫮繕?biāo)蛋白質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中。

為了獲得有活性的多肽藥物，我們通過(guò)基因工程方法，采用pWaldoGFPe載體構(gòu)建NR2Pep的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒[16]，并在NR2Pep的氨基端插入TAT穿膜肽，羧基端連接GFP報(bào)告蛋白，同時(shí)為方便后續(xù)純化，在TAT-NR2Pep和GFP之間插入TEV蛋白酶的酶切位點(diǎn)。GFP可為NR2Pep的表達(dá)純化和功能研究提供便利，而TAT將賦予NR2Pep穿過(guò)血腦屏障和細(xì)胞膜的功能，有利于后期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用。

我們優(yōu)化了NR2Pep的原核表達(dá)條件和純化方法，驗(yàn)證了TAT-NR2Pep-GFP穿過(guò)CHO和C2C12細(xì)胞膜的活性，為進(jìn)一步闡明NR2Pep多肽參與鎮(zhèn)痛的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 NR2Pep多肽表達(dá)載體的構(gòu)建

通過(guò)引物重疊PCR方法克隆TAT-NR2Pep序列，上游引物為 5′-CCATCTCGAGATGTACGGTCG TAAAAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTCGTCGCGAAT TTGATGAGATTG-3′，下 游 引 物 為 5′-CGTCGGAT CCCGGACGGCGACGATATGCCAGTTCAATCTCATC AAATTCGCGACG-3′，并于上下游引物兩端分別插入XhoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。應(yīng)用酶切連接法將PCR產(chǎn)物插入原核表達(dá)載體pWaldo-GFPe，得到重組質(zhì)粒pWaldo-TAT-pep。重組子質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后，送金唯智公司測(cè)序。

1.2 NR2Pep多肽的誘導(dǎo)表達(dá)

接種重組子于200mLLB培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種50mL培養(yǎng)物至1LLB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至D600nm為 0.5～0.6，加入終濃度為 0.1 mmo/L的IPTG，22℃繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)20h，6000r/min離心15min收集細(xì)胞，用于后續(xù)蛋白純化。

1.3 NR2Pep多肽的純化

將細(xì)胞懸浮于80mL裂解緩沖液［20mmol/LTris-HCl（pH8），300mmol/LNaCl］中，加入 50 μg/mL溶菌酶、200UDnaseⅠ和1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF），采用勵(lì)途（上海）細(xì)胞破碎儀800MPa破碎細(xì)胞一次，4℃、8000r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片，取上清液自然流過(guò)鎳柱，用100mL緩沖液［20mmol/LTris-HCl（pH8），300 mmol/LNaCl，10%甘油和30mmol/L咪唑］沖洗柱子，用高濃度咪唑［20mmol/LTris-HCl（pH7.5），300mmol/LNaCl，10%甘油和300mmol/L咪唑］洗脫目標(biāo)蛋白質(zhì)，收集蛋白質(zhì)樣品，過(guò)分子篩柱子［緩沖液含 20mmol/LTris-HCl（pH7.5），300 mmol/LNaCl，10%甘油］，收集有吸收峰的蛋白質(zhì)樣品，SDS-PAGE檢測(cè)樣品的純度。

1.4 熒光顯微鏡觀察NR2Pep進(jìn)入細(xì)胞的能力

CHO和C2C12細(xì)胞分別用含10%和20%胎牛血清的F12K和DMEM高糖培養(yǎng)基在37oC、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁情況，細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90%時(shí)加入純化的TAT-NR2Pep-GFP蛋白1mmol/L，并于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)孵育6h，利用融合蛋白中的GFP，通過(guò)熒光顯微鏡觀察TAT-NR2Pep-GFP能否穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。

1.5 Western印跡檢測(cè)

采用Western印跡確認(rèn)NR2Pep的表達(dá)。純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE后，通過(guò)半干轉(zhuǎn)/濕轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的PBS室溫封閉2h，加入6×His一抗室溫孵育1h，PBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育1h，PBST再次洗膜后加入發(fā)光液，X線膠片曝光、顯影、定影，圖像掃描后，條帶用ImageJ軟件進(jìn)行分析。

1.6 TEV蛋白酶酶切獲得TAT-NR2Pep多肽

確認(rèn)TAT-NR2Pep蛋白表達(dá)后，須將融合蛋白質(zhì)的GFP去除。于2mg蛋白樣品中加入3 mg/mL的TEV（煙草花葉病毒）蛋白酶約200μL，4℃冷室中旋轉(zhuǎn)酶切過(guò)夜；酶切后的蛋白質(zhì)樣品再次通過(guò)鎳柱去除沒(méi)有酶切完全的蛋白和帶有8×His標(biāo)簽的GFP組分，獲得高純度的TAT-NR2Pep多肽；收集通過(guò)Ni柱的蛋白質(zhì)樣品，用濃縮管（截留相對(duì)分子質(zhì)量1000）濃縮至1mg/mL左右（采用Nanodrop2000檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度）。

2 結(jié)果

2.1 TAT-NR2Pep基因的克隆

PCR克隆得到TAT-NR2Pep基因，通過(guò)酶切連接的方法將TAT-NR2Pep片段插入大腸桿菌表達(dá)載體pWaldo-GFPe，得到重組質(zhì)粒pWaldo-TAT-pep，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證表明基因片段大小符合預(yù)期（圖1），隨后送金唯智公司測(cè)序，TAT-NR2Pep序列正確，長(zhǎng)78 bp，編碼26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量 3600），和 GFP（相對(duì)分子質(zhì)量 26000）、TEV酶切位點(diǎn)融合后其相對(duì)分子質(zhì)量約為30600。

2.2 TAT-NR2Pep的誘導(dǎo)表達(dá)

誘導(dǎo)表達(dá)使用LB培養(yǎng)基，為了給蛋白質(zhì)更多的時(shí)間折疊以獲得正確的構(gòu)象，研究采用降低誘導(dǎo)劑IPTG濃度與表達(dá)溫度的方法，以更溫和的表達(dá)條件獲得較高表達(dá)量的活性蛋白質(zhì)。18℃和22℃恒定溫度下IPTG濃度0.1～1.0mmo/L變化對(duì)蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯影響（圖2D、E），0.1mmo/L IPTG條件下溫度升高（30℃）會(huì)降低熒光蛋白的含量（圖2E）。優(yōu)化后的表達(dá)條件為：終濃度0.1 mmo/L的IPTG，22℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20h（4L培養(yǎng)基約收集細(xì)胞18g）（圖2A），經(jīng)SDS-PAGE分析和Ingel檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白表達(dá)量較高，且綠色熒光明顯（圖2），證實(shí)構(gòu)建的重組子和表達(dá)條件可用于后續(xù)蛋白純化。

圖1 TAT-NR2Pep穿膜肽過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證

2.3 TAT-NR2Pep的純化

將細(xì)胞懸浮于裂解液中，經(jīng)細(xì)胞破碎儀破碎，4℃、8000r/min離心30min后，綠色熒光蛋白位于上清液中，綠色明顯（圖2B）。將上清液中的蛋白質(zhì)經(jīng)鎳柱親和純化后上分子篩柱子，柱子中可見(jiàn)明顯綠色組分（圖2C）。綠色熒光蛋白的存在可以幫助隨時(shí)定位目標(biāo)蛋白。

2.4 熒光顯微鏡觀察TAT-NR2Pep的穿膜活性

細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1mmol/L純化的TATNR2Pep并孵育6h，通過(guò)熒光顯微鏡能夠觀察到細(xì)胞內(nèi)存在大量綠色熒光，說(shuō)明TAT-NR2Pep能夠穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞（圖3）。

2.5 Western印跡檢測(cè)TAT-NR2Pep的表達(dá)

純化得到的TAT-NR2Pep樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，加入6×His特異性抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，經(jīng)X線膠片曝光、顯影、定影，掃描得到圖4，發(fā)現(xiàn)6×His抗體特異性較高，在相應(yīng)位置有清晰的蛋白條帶，無(wú)明顯的雜帶。圖4結(jié)果一方面證實(shí)所構(gòu)建載體和優(yōu)化方法能夠表達(dá)和純化得到TAT-NR2Pep，另一方面表明TATNR2Pep能夠被TEV蛋白酶切割，最終獲得高質(zhì)量的TAT-NR2Pep多肽。

圖2 TAT-NR2Pep的表達(dá)純化與In-gel檢測(cè)

2.6 TEV蛋白酶酶切獲得TAT-NR2Pep多肽

純化得到的TAT-NR2Pep樣品帶有GFP標(biāo)簽，可用TEV蛋白酶酶切，將多肽和GFP組分分開(kāi)（圖5A）。隨后經(jīng)鎳柱二次純化，得到較純（＞80%）的目標(biāo)多肽（圖5B）。

3 討論

疼痛是一種復(fù)雜的與組織損傷或潛在損傷相關(guān)的不愉悅的主觀感覺(jué)和情感體驗(yàn)，是多種疾病的共同特征，其發(fā)生機(jī)制和鎮(zhèn)痛治療一直是研究的熱點(diǎn)。隨著對(duì)疼痛發(fā)生機(jī)制和藥物鎮(zhèn)痛機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)多種受體和離子通道與疼痛有關(guān)，其中包含電胝依賴性鈉離子通道和鈣離子通道、Ach能受體和阿片肽受體等。作用于這些離子通道和受體的藥物在臨床已得到廣泛應(yīng)用。

臨床鎮(zhèn)痛藥物多為阿片類和非甾體類，這些藥物對(duì)慢性神經(jīng)源性等疼痛癥狀療效不理想，而且阿片類鎮(zhèn)痛藥往往伴隨成癮性、依賴性等毒副作用。所以，近年來(lái)篩選特異性高、安全、副作用小的天然鎮(zhèn)痛藥物成為新藥研究熱點(diǎn)，而多肽類藥物因其自身優(yōu)勢(shì)，成為藥物研發(fā)的重要方向。

圖3 熒光顯微鏡下觀察TAT-NR2Pep的穿膜活性（10×）

圖4 Western印跡確認(rèn)TAT-NR2Pep的表達(dá)

圖5 TAT-NR2Pep的TEV酶切與純化

本實(shí)驗(yàn)室研究疼痛機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)前扣帶皮層中微囊蛋白1可直接和NR2B結(jié)合，從而提高NR2B在細(xì)胞膜表面的表達(dá)水平，進(jìn)而參與慢性神經(jīng)病理性疼痛的調(diào)節(jié)，而NR2Pep小肽則能夠通過(guò)阻斷這種相互作用而起到良好的鎮(zhèn)痛效果。為了大量生產(chǎn)這種多肽藥物，本研究構(gòu)建了小肽的細(xì)菌表達(dá)和純化系統(tǒng)，通過(guò)生物發(fā)酵的方法進(jìn)行了大量表達(dá)。并且為了方便獲得的多肽能夠作為藥物使用，我們?cè)谄銷端加入了穿膜肽TAT，幫助多肽獲得穿過(guò)細(xì)胞膜的特性。

當(dāng)然，目前多肽藥物的純度仍不夠高，我們后期將進(jìn)一步增加純化步驟，爭(zhēng)取將多肽純度提高到98%以上，并作為藥物在小鼠體內(nèi)檢測(cè)其活性，確認(rèn)NR2Pep能否通過(guò)血腦屏障，是否能夠和合成肽一樣具有鎮(zhèn)痛效果，作為鎮(zhèn)痛藥物是否有耐藥性等。并對(duì)NR2Pep做進(jìn)一步的改造或修飾，以提高其鎮(zhèn)痛活性或延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，同時(shí)將探討NR2Pep在腦中的代謝，為NR2Pep的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

總之，我們構(gòu)建了NR2Pep的原核表達(dá)系統(tǒng)，純化得到較高純度的NR2Pep，體外證實(shí)NR2Pep具有穿過(guò)不同細(xì)胞的細(xì)胞膜的活性，為下一步闡明NR2Pep參與鎮(zhèn)痛的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他多肽藥物的生物發(fā)酵研究提供了參考。