于曉晨，梁劍青，王嫚娜，牛祖彪，陳昭烈，孫強

軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

細(xì)胞內(nèi)的著絲粒相關(guān)蛋白檢查點蛋白（checkpointprotein，CP）是細(xì)胞分裂監(jiān)控體系中的重要組成部分，有絲分裂阻滯缺陷蛋白2（mitoticarrest deficientprotein2，MAD2）作為CP蛋白的重要成員，在控制有絲分裂周期的正常進行中發(fā)揮著重要作用[1-2]。MAD2可以與CDC20結(jié)合[3]，共同參與有絲分裂紡錘體檢查點復(fù)合物（spindleassemblycheckpoint，SAC）的形成[4]，抑制有絲分裂中期向后期的進展，防止染色體分離錯誤。當(dāng)有絲分裂中期姐妹染色單體正確地連接于紡錘體上，MAD2與CDC20解離，SAC復(fù)合物失活，CDC20激活泛素連接酶分裂后期促進復(fù)合體或循環(huán)體（APC/C），促進細(xì)胞周期阻滯蛋白的降解，有絲分裂中期向后期正常進展；若有絲分裂中期異常，則會激活SAC復(fù)合物，將細(xì)胞阻滯在分裂中期[5-6]。MAD2的異常會導(dǎo)致紡錘體檢查點的功能減弱或消失，無法監(jiān)控腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常的動粒-微管結(jié)合，使染色體出現(xiàn)異常分離，造成細(xì)胞核型的非整倍體異常而導(dǎo)致腫瘤[7-8]。因此，MAD2與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4]。

為動態(tài)追蹤細(xì)胞有絲分裂中期阻滯，實時標(biāo)記周期阻滯的細(xì)胞，并檢測MAD2分子在細(xì)胞分裂周期里的亞細(xì)胞分布變化，我們構(gòu)建了MAD2與綠色熒光蛋白（EGFP）的融合蛋白，并初步檢測了EGFP-MAD2融合蛋白表達(dá)對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠有效表達(dá)EGFP-MAD2融合蛋白，并誘導(dǎo)細(xì)胞在G2/M其發(fā)生阻滯，為隨后的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細(xì)胞293FT細(xì)胞由本實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans10、dNTPs、TaqDNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；包含目的基因MAD2的質(zhì)粒購自義翹神州生物技術(shù)有限公司；pQCXIP-EGFP-N1載體由本實驗室提供；pGEM-T載體購自Promega公司；實驗所需的Q5超保真DNA聚合酶，T4DNA連接酶，EcoRⅠ、BamHⅠ限制性內(nèi)切酶及Cutsmart酶切緩沖液均購自NewEnglandBiolabs公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；脂質(zhì)體Lipo?fectAMINE2000購自Invitrogen生命技術(shù)有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Macgene公司；胎牛血清FBS購自PAN-Biotech公司；PCR引物由中美泰和生物技術(shù)（北京）有限公司合成。

1.2 pQCXIP-EGFP-MAD2表達(dá)載體的構(gòu)建

分別以pQCXIP-EGFP-N1載體及包含目的基因MAD2的質(zhì)粒為模板，設(shè)計2對PCR擴增引物，其中EGFP的3′端引入限制性酶切位點BamHⅠ，MAD2的5′端引入限制性酶切位點EcoRⅠ，通過PCR擴增技術(shù)獲得EGFP和MAD2基因片段。為了提高融合基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性，引物設(shè)計時增加了同源互補的連接肽（Linker）。引物為EGFP-F（GGATC?CATGGTGAGCAAGGGCGAG）、EGFP-R（CCTCCTCC TCCTCCTCCGTCGACCTTGTACAGCTCGTCCATGCC）、MAD2-F（TCGACGGAGGAGGAGGAGGAGGAATGGCGC TGCAGCTCTC）、MAD2-R（GTAGAATTCTCAGTCATT GACAGGAATTTTGTAGGCC）（斜體字部分為同源互補序列）。EGFP和MAD2擴增產(chǎn)物電泳后回收混合作為模板，用EGFP-F和MAD2-R引物對進行重疊PCR，擴增獲得EGFP-MAD2融合基因。PCR反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸45s，33個循環(huán)；72℃延伸2min。

將EGFP-MAD2融合片段克隆入pGEM-T載體進行測序測定。取測序正確的pGEM-TEGFP-MAD2質(zhì)粒和表達(dá)載體pQCXIP-EGFP-N1，分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/EcoRⅠ和BamHⅠ/MfeⅠ雙酶切，利用EcoRⅠ和MfeⅠ是同尾酶的原理，將融合片段EGFP-MAD2插入pQCXIP-EGFPN1載體，獲得重組表達(dá)載體pQCXIP-EGFP-MAD2（圖1）。

1.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞

293FT細(xì)胞按1.5×104/孔接種于12孔板內(nèi)，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)約24h，細(xì)胞生長至匯合度50%～60%時，將pQCXIP-EGFP-MAD2表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，質(zhì)粒與LipofectAMINE2000的用量比為0.5 μg∶1 μL（轉(zhuǎn)染按說明書操作）。對照組轉(zhuǎn)染空載體pQCXIPEGFP-N1。

圖1 pQCXIP-EGFP-MAD2重組表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖

1.4 融合基因表達(dá)檢測與細(xì)胞周期分析

轉(zhuǎn)染72h后用熒光顯微鏡（NikonEclipse）同時采集對照質(zhì)粒和pQCXIP-EGFP-MAD2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293FT細(xì)胞圖像（DIC和FITC通道），觀察熒光蛋白表達(dá)情況。

熒光顯微鏡采集圖像后回收細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。消化細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，2000r/min離心5min；棄上清，用0.5mL1%多聚甲醛重懸，避光固定10min；1000r/min離心3 min，棄上清，用 3～5mLPBS清洗 3次，PBT（以PBS為溶劑，含0.1%TritonX-100，0.5%BSA）清洗1次；再次離心后用PI染液（以PBT為溶劑，含100 μg/mLRNaseA，50 μg/mL碘化丙啶）重懸細(xì)胞，避光37℃孵育1h或4℃過夜；PBS清洗2次后重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度約為106/mL，用流式細(xì)胞儀（BectonDickinson）進行分析。

2 結(jié)果

2.1 pQCXIP-EGFP-MAD2表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以pQCXIP-EGFP-N1載體及含有MAD2基因的質(zhì)粒為模板，PCR擴增EGFP和MAD2的基因片段，產(chǎn)物長度分別為746和650bp。通過重疊PCR將2個片段拼接為EGFP-MAD2，產(chǎn)物長度為1374bp，DNA凝膠電泳驗證產(chǎn)物與理論基因片段長度一致（圖2A）。將EGFP-MAD2基因片段與pGEM-T載體連接，獲得重組質(zhì)粒pGEM-TEGFP-MAD2，通過測序驗證EGFP-MAD2基因序列正確，無突變或缺失。取測序驗證正確的pGEM-T-EGFP-MAD2質(zhì)粒和表達(dá)載體pQCXIPEGFP-N1，經(jīng)雙酶切連接，將融合片段EGFPMAD2插入pQCXIP-EGFP-N1載體，獲得重組表達(dá)載體pQCXIP-EGFP-MAD2。隨機挑取8個單菌落進行菌液PCR驗證，結(jié)果顯示4號和7號克隆的目的基因連接成功（圖2B），取7號單克隆測序分析，測序結(jié)果表明EGFP-MAD2基因序列正確，無突變或缺失（圖2C）。

2.2 EGFP-MAD2融合蛋白在293FT細(xì)胞中的表達(dá)

將pQCXIP-EGFP-MAD2質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，72h后在熒光顯微鏡下可見293FT細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)（圖3）。轉(zhuǎn)染pQCXIP-EGFP-MAD2質(zhì)粒的細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)效率和表達(dá)水平都顯著高于對照組pQCXIPEGFP-N1，且視野中容易觀察到被阻滯在有絲分裂中期的細(xì)胞（呈圓球狀，圖3箭頭所示），約占細(xì)胞總數(shù)的1/3，提示MAD2基因表達(dá)可能阻滯細(xì)胞G2/M期的進展。

圖2 pQCXIP-EGFP-MAD2載體構(gòu)建及序列分析

2.3 流式細(xì)胞術(shù)分析EGFP-MAD2表達(dá)對293FT細(xì)胞周期的影響

由于對照載體pQCXIP-EGFP-N1與重組載體pQCXIP-EGFP-MAD2的綠色熒光表達(dá)量不同，通過設(shè)定相同的閥值M1獲得綠色熒光細(xì)胞群，排除未表達(dá)或表達(dá)量低的細(xì)胞干擾，進一步分析細(xì)胞周期。流式分析結(jié)果（圖4）顯示，超過一半的EGFP-MAD2表達(dá)細(xì)胞處于G2/M期（54.1%），顯著多于EGFP對照組的22.4%，表明融合了EGFP的MAD2蛋白仍然能夠有效地誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M阻滯。

3 討論

MAD2作為有絲分裂紡錘體檢測點SAC復(fù)合物的關(guān)鍵蛋白，在調(diào)控細(xì)胞正常有絲分裂方面發(fā)揮著重要作用[9]，當(dāng)細(xì)胞周期進程中出現(xiàn)DNA損傷或復(fù)制受阻等異常事件時，監(jiān)控點激活，及時中斷細(xì)胞周期運行，防止異常的染色體分離[10]。MAD2基因影響多種腫瘤如胃癌、大腸癌、結(jié)直腸癌、喉鱗狀細(xì)胞癌等的發(fā)生和發(fā)展，臨床標(biāo)本分析顯示MAD2的表達(dá)與多種腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，可以作為腫瘤惡性程度判定、預(yù)后分析及腫瘤臨床治療的重要參考指標(biāo)[4,11-14]。而沉默MAD2基因的表達(dá)，能夠顯著抑制腸癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞遷移、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，MAD2基因被認(rèn)為是腫瘤防治的一個潛在靶點[15-16]。

圖3 EGFP-MAD2融合蛋白在293FT細(xì)胞中表達(dá)

圖4 MAD2表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期G2/M期阻滯

為實現(xiàn)實時追蹤MAD2蛋白分子在細(xì)胞內(nèi)的分布定位，指示MAD2過表達(dá)的細(xì)胞，我們將MAD2與EGFP融合構(gòu)建融合蛋白，考慮到EGFP蛋白的分子略大于MAD2，直接融合后可能會影響MAD2分子的折疊和功能發(fā)揮，我們在2個分子間加入了一段8個氨基酸殘基的連接短肽，鑒于以往文獻中將短的標(biāo)簽（如HA等）融合于MAD2分子的N端，我們將EGFP分子也融合在MAD2分子的N端，并在EGFP分子的起始密碼子前端設(shè)計了Kozak序列以增強融合蛋白的翻譯效率。將構(gòu)建的EGFP-MAD2融合基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)入293FT細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可以看到與對照EGFP相當(dāng)甚至更強的綠色熒光信號，提示EGFP-MAD2融合蛋白得到了有效表達(dá)，與此相對應(yīng)，流式細(xì)胞分析顯示表達(dá)EGFP-MAD2融合蛋白的細(xì)胞在G2/M期的比例顯著增加，提示融合蛋白仍然具有誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M阻滯的功能。以上結(jié)果表明，我們構(gòu)建了可用于活細(xì)胞成像和實時動態(tài)追蹤的EGFP-MAD2融合蛋白，而EGFP在MAD2分子N端的融合并不影響其細(xì)胞學(xué)功能，可以用于后續(xù)的功能研究。